原代细胞分离提取的注意事项

​　　原代细胞分离是指将组织分散制成细胞悬液后从中获取目的细胞的过程，获得高纯度、高活性的原代细胞则是很多细胞实验成功的关键要素之一，但是，很多小伙伴会在这个关键步骤会出现问题，今天我们就主要来聊聊这个问题。
 

　　首先，原代细胞分离的方法有很多种：

　　原代细胞是直接取自活组织(例如活组织检查材料)的细胞，并建立用于体外生长。这些细胞经历了非常少的群体倍增，因此与连续(肿瘤或人工永生化)细胞系相比，它们更能代表它们所衍生组织的主要功能成分，使得原代细胞成为更具代表性的体内模型。

　　所以，自己动手分离原代细胞，是非常有必要的。

　　原代细胞分离方法有许多种：悬浮离心法、直接组织块法、酶消化法、非酶消化法、机械分散法等，今天，我们主要来看看最常用的方法——酶消化法。
 

　　原代细胞分离提取优化七步法

　　1、无菌

　　确保使用无菌设备、试剂和技术收集和处理组织。使用个人防护设备以避免污染。使用0.22微米的膜无菌过滤所有酶和试剂。

　　2、切块

　　用无菌剪刀或手术刀将组织标本切成小块(通常为2×4mm)，然后将小块放入选定的缓冲液、培养基或盐溶液中。

　　3、加酶

　　将组织清洗三次以消除多余的血液蛋白，然后加入您选择的酶如胶原酶、蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶。通常，约0.5 mg/ml～1.5 mg/ml的酶。

　　4、孵育

　　将组织样本在其最佳温度下孵育，通常在37℃下孵育30～90分钟。定期混合或轻轻摇动标本。

　　5、洗涤

　　通过轻轻移液来分散细胞(也称为研磨)，然后，使用细网过滤细胞悬浮液。让细胞沉淀并滗出多余的含液酶;洗两到三次。含有FBS，BSA或其他抑制剂的洗涤溶液也可用于阻止酶消化。

　　6、分析

　　将细胞重悬于正确的培养基或缓冲液中，然后定量测定细胞产量和活力。这是细胞分离过程中的重要步骤，因此您可以评估解离技术的结果。大多数研究人员使用血细胞计数器测定细胞产量，并使用台盼蓝重氮染料测量细胞活力。

　　7、培养

　　这个适合，就可以根据所分离的细胞来选择最适合研究的方案和处理步骤来培养细胞了。
 

　　重点注意事项：

　　1、使用细胞分离酶时，请注意温度和湿度条件。如蛋白水解酶可以自动分解，因此建议在使用前立即将其溶解，并在冰上保存2°C～8°C。

　　2、通常用于细胞分离的大多数酶可以直接溶解于平衡盐溶液或所选缓冲液中。对于许多细胞分离中，确保解离期间的组织存活，需要孵育培养基充分氧化并在生理pH下缓冲。95%O2、5%CO2平衡的介质来完成。