细胞学堂 | 悬浮细胞培养异常解决方法

悬浮细胞大多胞体呈圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长，容易大量繁殖。悬浮细胞培养虽比贴壁细胞少了消化的步骤，但培养起来同样不易。有碎片、形态改变、生长速度慢、细胞贴壁……每一种异常都牵动着我们的心。

因此本期细胞学堂整理了悬浮细胞收货和培养过程中的常见问题，并针对各个问题列出解决办法，带你逐个击破！

 

运输常见问题及处理方法

 

1.碎片多

● 处理方法：悬浮细胞受到运输或者其他因素导致细胞损伤时，容易产生细胞碎片，碎片可通过低速离心（800~1000rpm，3min）去除；低速离心同时也会丢失细胞，故细胞密度低的时候不适用，细胞密度低时应正常转速离心，保留细胞优先。

 

2.细胞不圆/形态变了/聚团

● 处理方法：悬浮细胞受到运输或者微环境变化影响时，可能出现变形，聚团等现象，在使用正确培养基和操作都正确的情况下，一般继续培养一周左右可以恢复原状。

 

培养过程常见问题及处理方法

 

1.细胞不圆/形态变了/聚团

处理方法如下：

● 少量细胞聚团、呈葡萄串状，属于正常现象，特别是细胞密度较低时，易出现这种情况。通过静养（少操作，少观察） 、补加血清（5%）等方式，让细胞密度增高逐渐适应环境后可以恢复正常；
● 血清品牌会影响细胞生长状态，如果一种不会聚团的细胞，养出来全部聚团，分散的细胞很少，这时候要考虑血清的影响。

 

2.细胞生长慢或不生长

● 处理方法：悬浮细胞有密度依赖性，在高密度下状态比较好，低密度时状态较差，所以传代比例要控制，细胞状态不好时，传代可以不用离心法，而是补液或者半换液的方式，以避免离心损失细胞。

 

3.细胞发生贴壁

处理方法如下：

● 细胞培养瓶静置时间太长，细胞沉底后会出现少量贴壁现象，但这种贴壁非常松，吹一下或拍一下细胞就可以起来；此现象为正常现象，无需特殊处理。
● 如果细胞贴的非常紧，形态已经变成类似于上皮样时，需考虑是否为细胞特性或者有其他因素刺激导致；
● 日常操作避免染菌以及使用优质血清是预防悬浮细胞贴壁的有效方法。

 

培 养 小 贴 士

① 悬浮细胞常规推荐接种密度：3-5×10⁵cell/mL，生长到2×10⁶cell/mL左右可继续传代；该密度建议为理论值，实际按照每个细胞特性有波动；
② 培养悬浮细胞需要稳定的生长环境，少操作，少观察，更有利于细胞生长；
③ 不建议将聚团的细胞频繁吹散，等待密度高和状态改善时，细胞会自行散开；部分细胞聚团生长为特性，吹散不利于生长，请注意查看相关培养说明；
④ 有些细胞本身就是聚团生长(NK92,NK92MI,JURKAT,H209,ATT20等)，有些细胞本身就形态不圆（H9等），为正常现象，无需特殊处理；
⑤ 竖瓶培养可以促进细胞生长，但由于拿出来观察时都是横瓶，观察久了细胞会贴到底部，观察完再次竖起来就会有细胞挂在瓶底部，而细胞没有培养基滋润很快就会死掉并残留在壁上，从而导致养着养着细胞越来越少，贴壁细胞越来越多；因此，在培养瓶竖置操作时需注意吹下培养瓶底部的细胞，避免细胞残留。