原代细胞分化常见问题答疑

细胞的分化是一个非常复杂的过程，也是当今生物学研究的热点之一。4月13日，普诺赛进行一场关于“原代细胞分化问题”的直播，邀请普诺赛技术总监尚老师进行了分享，不仅介绍了常见原代细胞分化的类型，还深入探究了影响原代细胞分化的几大因素。直播回放可以点击公众号菜单栏【资料中心】- 【往期直播回放】查看学习。

 

直播过程中，很多老师就原代细胞分化问题提出了疑问，我们筛选出部分代表性问题，并作了详细解答。

 

Q1

用RANKL诱导RAW264.7形成破骨细胞，RAW264.7细胞应该如何选择？对传代要求有范围吗？

RAW264.7是一个成熟的细胞系，本身无差异，要做诱导实验，首先要保证细胞处于未分化状态，一般传代越多分化越多状态越差，建议复苏5代以内实验。

 

Q2

骨髓间充质干细胞自发成骨分化很强怎么办？

骨髓干细胞自发分化，一般是细胞增殖代数、培养基血清因素、细胞高密度抑制等原因，其中密度影响较大，其次是血清影响、代次影响，需要从这三点考虑分析。控制细胞密度避免过大、选用较好血清或无血清培养、控制代次避免超过10代以上。

 

Q3

肝星状细胞LX-2，正常培养时是属于静止期吗？是否会慢慢被激活呢？还是说外源添加TGF-β刺激才被激活？

肝星状细胞的激活受外部影响，其中细胞的增殖传代影响较大，一般LX-2细胞系在体外接近于静息态，传代太多会诱发激活态，也可用TGF-β刺激激活。

 

Q4

 EpCAM可以作为上皮细胞的标志物吗？EpCAM可以证明是乳腺癌细胞吗？

CD326是一种上皮细胞特异性粘附分子，又称作上皮细胞特异性粘附分子(EpCAM)，CD326广泛表达于上皮细胞来源的正常及其肿瘤细胞。可以作为上皮标志物，但无法证明是乳腺癌。

 

Q5

胚胎成纤维细胞具有干细胞的分化潜能吗？胚胎提取的细胞是否都具有一定的分化潜力呢？

胚胎还处于发育阶段，内部细胞还没有完全分化完成，大部分细胞都具备一定分化潜力，只是有些分化能力低、有些高。胚胎成纤维细胞接近终末分化，可以分泌多种胚胎干细胞生长的因子，在体外培养可以经过诱导刺激转分化成脂成骨等，也可诱导重编程为干细胞。

 

Q6

原代骨髓间充质干细胞是不是很难消化？贴壁很强，是和细胞状态相关吗？

原代骨髓间充质干细胞较易消化，一般1-3min即可，若细胞很难消化，贴壁很强，考虑细胞是否已经分化，或者细胞不是间充质干细胞（可能为巨噬细胞样）。

 

Q7

成纤维细胞体外培养过程会被激活吗？在研究成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的过程中，还没有用TGF-β刺激的时候，就发现有高水平的aSMA。

成纤维细胞在体外培养是保留有转化能力的，在密度过高或者培养代次过多，时间较久或者状态受损是可以诱发转化过程的。

 

Q8

诱导树突状细胞除了加肿瘤坏死因子还需要注意什么？

诱导树突细胞主要影响因素还是诱导因子种类、浓度、效果，以及诱导前细胞密度和状态，除肿瘤坏死因子外还需GM-CSF、IL-4等。

 

Q9

牙源性干细胞原代培养，组织块不容易贴壁，怎么办？

原代培养中组织块不贴壁，可以尝试包被培养瓶，增强吸附；也可以适当减少培养液，减少漂浮；还可以长时间静置促进沉降。

 

Q10

小鼠胚胎成纤维做饲养层细胞，培养过程有什么需要注意的地方吗？

小鼠胚胎成纤维做饲养层，一般要注意丝裂霉素处理时，保证细胞活性，处理时控制细胞密度避免过大，防止细胞脱落。

 

Q11

干细胞培养时传代的推荐比例是多少呢？

干细胞培养的比例一般为1:3-1:5传代较好。

 

Q12

EMT以后的成纤维细胞有没有干性？还能分化到其他细胞吗？常说的胚胎来源的成纤维细胞，干性如何？

细胞发生EMT转化后，从完全上皮（分化）转化到完全间充质化状态（未分化），未分化态有一定的分化能力，中间过程则是各种杂化状态，具体干性强弱要实际实验。