直播答疑 | 贴壁细胞培养要点解析

贴壁细胞是一种常见的细胞类型。6月1日，普诺赛就“贴壁细胞培养要点”进行了一场直播分享，就贴壁细胞的生长特点、影响贴壁的因素等进行了分享，并结合293T、Hacat两个细胞案例进行了深入探讨。直播回放可以点击普诺赛公众号菜单栏【资料中心】-【往期直播回放】查看学习。

 

直播过程中，很多老师就贴壁细胞培养提出了疑问，本期推文筛选出部分代表性问题，作了详细解答。

 

01

有些贴不牢的细胞，应该怎么处理？

贴壁不牢的细胞培养时，除了应选择合适的TC处理的培养容器外，还可以采用以下方法增加细胞的贴壁能力：

1

包被培养容器，如用多聚赖氨酸、明胶、鼠尾胶原等物质来处理容器底部，具体方法可以参考相应产品的使用说明；

2

如没有以上可用的包被材料，可以先用血清铺满容器底部，静置30min左右，再用于培养细胞，也可以增加贴壁效果；

3

培养过程中，在细胞开始贴壁的阶段，适量增加血清浓度，促进细胞贴壁，待细胞贴壁后换用正常浓度血清培养，血清浓度一般不超过20%即可；

4

在培养过程中应减少机械扰动或温度刺激，防止细胞脱落。

 

02

AR42J细胞传代和种瘤的时机如何选择？

AR42J细胞生长时为聚集呈团生长，细胞团扩张能力有限，一般48h左右状态稳定，观察此时细胞团大小，当细胞团生长至初始状态3-4倍时即可正常传代；细胞接种成瘤时应保证细胞状态稳定且处于对数生长期，具体为刚复苏的细胞应正常传代2-3次，细胞生长旺盛时进行接种。

 

03

平铺和岛状生长的hepg2细胞，有什么区别？

Hep G2细胞正常应该是呈岛状生长，密度较大时可能会出现堆积生长，只有经过特殊处理才会铺成单层细胞，但同时形态也会发生变化。

 

04

消化下来的细胞成团，可以再消化吗？

消化下来的细胞团，如发现细胞仍呈多个细胞聚集的状态（一般3-5个细胞聚集不影响后续生长状态，聚集的细胞团过大，会影响贴壁，或是贴壁之后成团生长），可以将细胞离心收集后，加1mL 0.25%胰蛋白酶消化1-2min，之后加入含血清的培养基中止即可正常吹散成单个细胞。

 

05

传代标准是什么？细胞长到什么程度可以传代？

对于一般单层生长的贴壁细胞来说，生长至80-90%汇合度即可进行传代；但实际操作过程中，很多细胞的汇合度不好判断，比如成片生长的细胞，当发现细胞扩张至初始面积的3-5倍大小，且中间的细胞开始出现形态变小，边缘变模糊等情况都可以进行传代；对于非单层生长的细胞，如LNCaP细胞，当出现聚集集落变大，中间的细胞形态变模糊，甚至出现有细胞开始脱落漂浮时，应进行传代。

 

06

消化的时候，怎么判断是否可以直接接种呢？

细胞消化之后，判断是需要离心去胰酶再培养还是可以直接接种，可以从两个方面进行考虑：

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消化过程中胰酶的残留量。如果消化过程是用胰酶浸润细胞后将多余胰酶去除，残留胰酶较少，等细胞消化好之后可以加培养基中止后直接培养。如果残留细胞本身难消化，残留胰酶较多，或者采取分次消化，则建议收集细胞后离心去胰酶再接种培养；

2

细胞对于胰酶的敏感程度。残留的胰酶在血清的抑制下酶活性很低，一般不会对细胞生长和状态造成影响，单有少量细胞对胰酶比较敏感，残留的胰酶会造成细胞边缘卷曲或展开不完全，此时传代后应离心去掉胰酶再接种培养。另外，在使用无血清培养基培养细胞过程中，消化后可加入含血清培养基中止再进行离心，或加入胰酶抑制剂后离心去除残留的胰酶。