6月29日，普诺赛就 RAW 264.7、SF9、NK-92这三个细胞进行了一场直播分享，分别详细讲解了三株细胞的培养方法及需要注意的问题。直播回放可以点击公众号菜单栏【资料中心】-【往期直播回放】查看学习。本期直播答疑，从直播间的提问中，筛选出其中有代表性的问题，逐一进行解答。

01

问  RAW 264.7细胞如何传代？用细胞刮刀对细胞有影响吗？一定要吹下来吗？吹不下来的是状态不好的细胞吗？

RAW 264.7细胞传代方法：

①　培养基中的漂浮的细胞离心收集

②　轻拍培养瓶，将贴壁松散的细胞拍起来

③　用1ml的枪把贴壁的细胞吹下来

④　将细胞悬液转移到15ml离心管

⑤　1200rpm 离心3min

⑥　去上清，用新鲜培养基重悬细胞

⑦　加入培养皿中（建议用培养皿，方便吹打）

 

当有较多圆形细胞不好吹下来时，可以使用细胞刮刀将细胞刮下来，使用细胞刮刀时需要注意：需要留适量培养基覆盖细胞，用细胞刮刀轻轻刮下细胞，朝一个方向刮，避免反复刮，这种方法可能会造成细胞损伤。

 

吹打不下来的细胞可能是分化的细胞，因为分化的细胞贴壁较牢。

02

问  RAW264.7细胞培养3天后依然漂浮严重，怎么办？

需要观察下细胞的增殖速度，细胞是否是聚团漂浮，如果细胞增殖且聚团漂浮的话，证明细胞活力是可以的。可以尝试将漂浮细胞收集，吹散成单颗，测细胞的数量和活力，培养传代时活细胞密度保持在1-1.5*10⁵/mL，多传几次，细胞就会贴壁展开了。

03

问  RAW264.7在诱导M2时，有的文章用IL-4加IL-10，只用IL-4去诱导差别大吗？M2极化多长时间？

文章中有关RAW264.7细胞在进行M2 型诱导时有的加 IL-4（20 ng/ml）或者 IL4+IL13 诱导、仿生层状壳聚糖支架（LCS），WB/QPCR 检测。主要是看相关指标检测结果（MR(CD206),ArgI 高表达），极化时间需要参考文献，最好是做下预实验，摸索下浓度和时间。

04

问  RAW264.7没传几代就开始分化了，要怎么补救？

细胞生长形态以圆形为主，存在梭形状态，此时细胞依旧处于分化程度较低的状态；细胞形态不规则，多触角状态时分化程度较高，贴壁牢固，强行吹打或细胞刮取不当会导致细胞进一步分化，传代时可选择只收集能够轻轻吹打下来的圆形细胞，这部分细胞分化程度最低，状态最佳，同时更换新的培养容器，可以每天将圆形细胞轻轻吹下来。

05

问  有什么办法，可以让RAW264.7生长慢些？

细胞倍增时间是12-30h，本身生长速度快，若是不想频繁传代，可以尝试扩大细胞的传代比例，降低培养基中的血清含量。

06

问  NK-92细胞如何传代？

细胞生长时聚集的细胞团会逐渐增大，正常的细胞团显微镜下为白色透亮的细胞团，若细胞聚团比较多，100倍镜下有6-8个大的细胞团可传代。

 

传代方法：将培养瓶轻轻晃几下，或者用移液器轻轻吹散（一般吹2-3次即可），吹打力度不可过大，不要全部吹散，否则会出现大量死细胞和细胞碎片。均分到两个瓶子里，每瓶再补充等量培养基；

 

细胞对营养要求也很高，不能团块过大大导致营养不足。

07

问  NK-92出现过大细胞团时怎么处理？

细胞团过大时，镜下观察团中部会发暗，中间的细胞会接触不到营养，可以用枪头轻轻吹1-2下，吹打力度不能太大，将团吹小，不要全部吹散。

08

问  NK-92细胞有些细胞碎片，如何去除呢？

NK-92细胞平常培养时是会有细胞碎片的，若是有大量碎片，可以一周低速离心一次（800rpm，3min），去除部分死细胞和细胞碎片。

 

https://www.dsmz.de/collection/catalogue/details/culture/ACC-488此数据库有关于细胞状态描述，细胞会存在一些碎片。

09

问  NK-92细胞活率一直都是80%-90%，达不到90%以上，正常吗？

NK-92细胞培养过程中死细胞和细胞碎片都悬浮在培养基中，培养过程中不会完全没有死细胞和细胞碎片，且细胞聚团悬浮，平常将细胞吹散成单颗测活力时，也会导致部分细胞损伤，所以活率在80-90%是正常的范围。

10

问  SF9驯化从含血清培养基过度到无血清培养基细胞一直长不起来是怎么回事？

驯化前细胞活率要比较高，能够达到90%以上，驯化过程需要把握好细胞的密度，避免接种密度过低，导致生长速度慢，若是有碎片可以采用800转离心去除。

11

问  bacmid转染SF9细胞，常规转染试剂可以吗？bacmid转染SF9成功的现象一般是什么？有没有参考文献？

可以采用Cellfectin® II 试剂，是一种阳离子脂质制剂，设计用于昆虫细胞的极-佳转染；PEI MAX也可用于转染，转染时可筛选出合适转染培养基，有利于转染效率。

 

一般会加一个GFP的对照质粒，3-4天后可观察是否有荧光反应，昆虫细胞转染后约5-7天后，大部分细胞变大病变，出现裂解的现象。

12

问  细胞出现小黑点，把双抗量加大，能抢救得过来吗？

首先要确认下黑点是什么污染，如果是细菌污染，污染物（黑点）较少，细胞形态和生长速度未收到影响时可以尝试5%双抗洗涤2遍，培养基中加大双抗比例，去除污染；如果不是细菌污染，加双抗是没有效果的，需要注意消化时间的把握，传代过程尽量少吹打。

13

问  支原体污染了会是什么样子的？

支原体污染的细胞一般表现为细胞背景脏，背景有大量细胞碎片，细胞生长速度也可能受到影响，具体是否是支原体污染需要进行进一步检测，单凭显微镜观察并不能确定是支原体污染。