微血管内皮细胞（microvascular endothelial cells,MVECs）构成了血液与组织液之间的物理屏障，而且在机体的凝血与抗凝血、致炎与抗炎及免疫应答等方面起着十分重要的作用，其体外培养模型广泛应用于相关研究。但由于不同组织器官的微血管内皮细胞之间存在较大的异质性，同时微血管内皮细胞因解剖部位不同，在形态学、表型和功能上等方面也存在明显异质性，不同来源的血管内皮细胞之间是不可相互替代的，主要包括肠、肺、心脏、脑、脉络膜、视网膜、真皮微血管内皮细胞等。 

本期细胞学堂为大家整理了微血管内皮细胞的提取、培养和鉴定方法及步骤，帮助您快速上手开展实验。

 

提取方法

微血管内皮细胞的提取和培养有酶消化培养法、组织块培养法、免疫磁珠法。

酶消化培养法

采用消化酶将对应组织内细胞间质如基质、胶原蛋白、纤维蛋白等解离，使细胞分散，形成单细胞悬液后再接种进行培养的方法。

主要包括：实验动物及日龄的选择(根据取材部位决定动物日龄）→对应部位的取材→组织的剪碎及清洗→加酶消化→离心去酶→计数后接种培养→细胞纯化→细胞鉴定；

组织块培养法

是将从体内取出的组织剪切成一定大小的组织块后，接种于培养瓶进行的培养。

主要包括：试验动物及日龄的选择(根据取材部位决定动物日龄）→对应部位的取材→组织的剪切→接种培养。

免疫磁珠法

通过在磁珠表面包被具免疫反应性的抗体进行抗原抗体反应，筛选或去除所标记的细胞，达到阳性或阴性选择细胞的目的。

主要包括：实验动物及日龄的选择(根据取材部位决定动物日龄）→对应部位的取材→组织的剪碎及清洗→加酶消化→离心去酶→加入磁珠与细胞孵育→磁珠磁力架分选→收集沉淀技计数→接种培养。

大鼠肺微血管内皮细胞提取示意图[1]

 

各种提取方法的优劣势

 

酶消化培养法

可以在短时间内得到大量细胞，但是操作繁琐，易污染，纯化步骤多，需要使用昂贵的胶原酶，导致成本偏高，并且酶浓度和消化时间需要摸索；

组织块培养法

成功率较高，成本低，适合于组织量少的原代培养，但是细胞迁出时间不好把握且组织块去除不彻底会造成其它杂细胞污染；

免疫磁珠法

得到的细胞纯度高，但是成本高，需要较多的细胞以备筛选和纯化。

 

注意事项

1、试验动物的日龄和健康状态可能会影响目的细胞的活性、代次；

2、取材部位的分离需要尽可能多的剔除多余组织以及保证无菌；

3、得到大小适中、容易贴壁的组织块是分离细胞的关键；

4、采用吹打法时，吹打管的规格、吹打的次数会直接影响细胞贴壁能力和细胞的纯度；

5、虽然各种酶的消化活力有一定的组织特异性，但由于任一组织器官均不是由单一的组织细胞成分构成，因此酶消化液常根据所分离培养细胞的种类等因素进行筛选；

6、采用酶消化法时，消化时间和温度的控制也特别重要。消化时间过长、温度过高不利于细胞的贴壁和伸展；消化时间过短、温度过低则达不到组织分离的目的；

7、建议使用内皮细胞专用培养基，培养基含有内皮细胞培养所需的微量元素、生长因子等；

8、建议包被处理（比如PLL、明胶等），促进内皮细胞贴壁，形态立体；

9、对于大部分细胞来说，同一种细胞，大鼠类的细胞代次会比小鼠细胞代次略高；

10、随着传代的增加，细胞的形态会发生变化。

 

鉴定指标

 

显微镜观察鉴定

可以初步观察细胞形态和生长规律，细胞呈鹅卵石典型的铺路石样、多角形、梭形，细胞核大而清晰；

贴块法获取的肺微血管内皮，呈铺路石样

 

贴块法获取微血管内皮细胞后进行消化转瓶，消化转瓶或者传代后细胞形态有变化

 

 

大鼠脑微血管内皮细胞提取过程[2]

 

特异性标志

目前使用较多的是FactorⅧ、 vWF、和CD31的阳性表达。

 

 

●参考文献●

[1]白祥慧，邹登朗，祁得胜，等. 大鼠肺微血管内皮细胞培养方法研究进展[J].畜牧兽医科学，2021.

[2]张帆. 单筛过滤法体外分离培养原代大鼠脑微血管内皮细胞及其鉴定[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2023.

[3]段佳熙，巨噬细胞外泌体介导慢阻肺微血管内皮细胞凋亡及其机制研究[D].中南大学，2022.

[4]免疫磁珠法分离培养小鼠原代骨骼肌微血管内皮细胞及鉴定[J].心脏杂志，2023.

[5]Wong E，Nguyen N，Hellman J.Isolation of primary mouse lung endothelial cells[J].J Vis Exp，2021，（177）：e63625.

[6]Sokol L，Geldhof  V，Garcia-Caballero M，et al.Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues:Small intestine,colon,heart,and liver[J].STAR Protoc，2021,2（2）：100489.