细胞学堂 | 一次吃透MC3T3-E1 Subclone 14细胞的成骨诱导

MC3T3-E1 Subclone 14细胞是从MC3T3-E1细胞系中分离出的亚克隆之一，在含抗坏血酸和3~4 mM无机磷酸盐培养基中生长表现出高水平的成骨细胞分化。MC3T3-E1 Subclone 24和MC3T3-E1 Subclone 30在含抗坏血酸培养基中生长表现出很差的成骨细胞分化，不形成ECM，可以作为MC3T3-E1 Subclone 14的阴性对照。

温度：液氮

气相：空气，95%；CO₂，5%

温度：37℃

MC3T3-E1 Subclone 14

细胞成骨诱导分化实验步骤

1、MC3T3-E1 Subclone 14细胞正常培养，细胞融合度达到80%~90%时，即可用胰酶消化，计数；

2、按2~3×10⁴ cells/cm²的细胞密度接种在12孔板中（具体接板数量以实际预实验情况为准），每孔加入1 mL的MC3T3-E1 Subclone 14细胞完全培养基；

3、将接种好的MC3T3-E1 Subclone 14细胞置于37℃，5% CO₂的培养箱中进行培养；

4、诱导试剂配置：MC3T3-E1 Subclone 14成骨诱导分化培养基由基础培养基、血清和添加物三部分组成，使用前将各组分混匀后即可得到成骨诱导分化完全培养基；

5、当细胞融合度达到80%~95%时，小心的将孔内完全培养基吸走，向12孔板中加入1 mL预热的MC3T3-E1 Subclone 14成骨诱导分化完全培养基；

6、每隔48~72h更换预热的新鲜的成骨诱导分化完全培养基；

7、诱导培养2~4周，期间注意观察细胞形态变化。根据细胞钙质结节形成的情况，决定是否进行下一步染色鉴定。

• 开始诱导时的细胞密度可控制在90%~95%，注意避免细胞过饱和导致细胞卷边漂起或者状态不佳。

• 实验开始前确保细胞状态，尽可能使用早代次的细胞开始实验。

• 细胞铺板需均匀，铺板不均匀可能导致分化不均匀、分化比例低、分化过程中细胞漂浮等问题。

• 由于诱导时间较长，为防止细胞脱落，可提前使用明胶包被培养板。

• 细胞换液或者添加诱导分化培养基时需注意：诱导分化培养基提前37℃复温；换液时可留一点原液作为缓冲，加液时枪头沿壁逐滴加入，操作应迅速，尽量避免在超净台内操作时间过长，同时手法要轻柔；这样对细胞的冲击最小，否则极易导致细胞卷边飘起。

• 避免长时间将细胞拿出培养箱外进行观察，并尽量减少培养板的晃动，以防细胞卷边或漂浮。

• 拍照时可留少量PBS，减少光圈的出现，以便呈现更好的拍摄效果。