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细胞学堂 | 重组蛋白表达通关秘籍，效率翻倍数据稳！
5684 人阅读发布时间：2025-05-30 13:16
蛋白质是生命活动的核心执行者，更是生物实验的关键材料，在基础生物学研究、疾病机制探索以及药物靶点等领域发现均扮演着重要角色。但传统的天然提取蛋白方法因受限于蛋白低丰度和样本异质性，纯度和质量难以保障。20世纪70年代，重组蛋白表达技术的出现，为这一难题带来了革命性突破。科学家利用这一技术，能有效提高蛋白产量和质量，推动生物医药和基础研究的进步。
本期细胞学堂围绕重组蛋白表达展开深入探讨，从表达体系选择到培养条件的细致优化，以助大家获得高纯度、高质量的蛋白。
01# 蛋白表达系统的选择
蛋白表达系统根据宿主类型可分为原核表达系统（如大肠杆菌）和真核表达系统（如酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞）（见表1）。不同表达系统在表达效率、翻译后修饰（如糖基化、磷酸化）、生产成本等方面各有优势。在选择表达系统时，需综合评估目标蛋白的性质、用途、成本预算以及表达周期等多方面因素，以确定适合的表达系统。
表1 常见的几种蛋白表达系统比较
|
表达系统 |
优势 |
局限性 |
适用场景 |
|
原核细胞（大肠杆菌BL21） |
成本低；周期短； 高表达 |
缺乏复杂修饰（如糖基化）；包涵体的变复性 |
适合结构简单、无需修饰的蛋白表达 |
|
酵母（酿酒、毕赤） |
生长快；操作简便；一定的翻译后修饰能力 |
糖基化方式与哺乳动物有所不同，可能影响蛋白的免疫原性和生物活性，且分泌表达水平有时较低 |
适用于需要一定程度翻译后修饰的蛋白 |
|
昆虫细胞（杆状病毒） |
复杂的翻译后修饰；较好的活性和折叠状态 |
成本高于原核系统 周期较长（需病毒扩增）；糖基化模式与哺乳动物仍有差异 |
适合于需要复杂糖基化和其他翻译后修饰的蛋白 |
|
哺乳动物细胞（CHO、HEK293） |
接近天然蛋白 |
成本高；周期长；技术门槛高 |
适合于治疗性抗体、复杂功能的蛋白 |
02#优化蛋白表达的策略
密码子优化
密码子优化技术是提升异源蛋白表达效率的关键手段，可从以下方面对密码子进行优化：
偏好性适配
根据宿主物种的密码子使用偏向性调整基因序列。例如，大肠杆菌倾向于使用GCT密码子（编码丙氨酸）而非GCC。将真核来源的GCC替换成GCT，可提高匹配宿主tRNA的丰度，提高翻译效率。
协调性优化
基于宿主tRNA丰度图谱重构密码子使用频率，减少核糖体停滞位点，从而优化翻译过程。
GC含量调整
将外源基因GC含量维持在宿主适应性范围内。一般GC含量应保持在40%-60%之间，避免GC含量过高（>70%）或过低（<30%）导致转录效率降低。
重复序列消减
连续10个以上的碱基重复序列容易引发同源重组，使质粒不稳定甚至丢失。用同义密码子的替换来打断重复区可降低风险。
mRNA结构解构
稳定的mRNA发卡结构（尤其靠近起始密码子处）可能会阻碍核糖体结合，降低翻译效率。改变局部序列打断发卡结构，能改善蛋白表达效率。
基因合成前需对密码子进行多维度优化，确保密码子序列、GC梯度及mRNA折叠等均符合宿主表达系统特性，从而实现高效、稳定的蛋白表达。
表达载体优化
表达载体作为介导外源基因进入宿主细胞并实现高效表达的关键工具，其元件通过直接或间接方式调控基因表达过程。
表达载体的元件主要包括以下几类：
核心的调控元件
启动子（promoter）、增强子（enhancer）、非翻译区（UTR）、聚腺苷酸尾（polyA）、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件（WPRE）
染色质互作元件
绝缘子（Insulator）、基质附着区（MARs）、核骨架附着区（STARs）、上游调控元件（UCOE）
辅助功能元件
信号肽
选择载体时，需结合宿主类型（如大肠杆菌菌株BL21、CHO细胞）与目标蛋白性质（分泌型/胞内型）。建议通过小规模实验筛选最优构建体，例如使用荧光报告系统定量分析不同组合的表达差异，从而实现蛋白产量最大化。
培养条件优化
培养条件的优化主要包括两个方面：培养基和培养过程相关工艺参数优化。
培养基
培养基的优化经历了从基础培养基到无动物源培养基的演变，旨在支持细胞的高密度生长和高产量表达重组蛋白。不同类型宿主细胞对营养成分的需求不一致。例如，哺乳动物细胞通常需要多种氨基酸、维生素、无机盐和生长因子；而细菌细胞则更依赖碳源、氮源及少量微量元素。此外，即使是同一种细胞系，其对营养物质的需求也可能因表达的重组蛋白不同而发生变化。因此，根据具体的宿主细胞类型和表达系统，选择并优化合适的培养基配方，是实现高效表达的重要前提。
培养过程工艺参数
细胞培养过程工艺参数直接关系到细胞生长和产物表达。常见关键参数包括温度、湿度、氧气浓度、二氧化碳浓度等。例如，大肠杆菌通常在37℃培养，但在诱导表达重组蛋白时，常将温度降低至20–25℃，以减缓细胞代谢速率，增强蛋白质的正确折叠，减少包涵体的形成，从而提高可溶性蛋白的产量。为了保证细胞的正常生长和蛋白的稳定表达，需要通过实验确定最佳工艺条件。此外，还可以利用在线或离线监测关键参数（如细胞形态、细胞密度、营养物质消耗等），并结合反馈调控策略，可保持培养过程的稳定性，保障目标产物的持续高效表达。
标签蛋白选择
蛋白标签是在重组蛋白表达过程中与目的蛋白融合表达的多肽或蛋白片段。其主要作用包括：增强目的蛋白的可溶性和稳定性；辅助目的蛋白检测与纯化。随着技术的发展，已经出现了多种类型的蛋白标签，可满足不同实验需求（见表2）。选择时需综合评估目标蛋白的理化特性、表达宿主兼容性及载体适配性等因素，以筛选适合标签。
表2 常见的蛋白标签及功能
|
标签 |
长度（aa） |
应用说明 |
|
His |
45698 |
对蛋白的空间结构影响极小，不会对目标蛋白功能产生太大影响，一般无需切除 |
|
HA |
9 |
来源于流感病毒的红细胞凝集素表面抗原决定簇，对目标蛋白的影响较小，常用于免疫检测 |
|
Flag |
8 |
亲水性高，通常不会使与其连接的蛋白质失活，常用于真核表达系统中 |
|
Fc |
约230 |
常用于构建融合蛋白，可增强稳定性或半衰期 |
|
Trx |
109 |
增强蛋白的可溶性表达，尤其在大肠杆菌系统中有效 |
|
GST |
211 |
具亲和纯化功能，部分情况下也有助于可溶性表达 |
|
MBP |
396 |
可增加目标蛋白在宿主中的溶解性，尤其是真核表达系统 |
|
SUMO |
约100 |
该标签主要用于改善目标蛋白的表达，并非常用的纯化标签，要用于纯化可采用双标签 |
注：不同来源的蛋白标签长度可能存在一定差异，上述表格中部分长度为常见值或近似值。
在实现重组蛋白高效表达的过程中，需构建一个从宿主筛选至工艺优化的多维度协同体系。这一体系涵盖基因设计、表达系统适配以及诱导条件优化等多个关键环节。唯有各环节紧密配合、协同作用，方能达成高产量与高质量兼备的重组蛋白表达目标。
以上是关于如何优化重组蛋白表达的详解。更多细胞培养干货，请持续关注细胞学堂专栏~
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