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公司新闻/正文
细胞学堂 | 永生化细胞：突破细胞“寿命枷锁”，释放科研无限可能！
575 人阅读发布时间：2025-06-27 14:26
在体外细胞实验中，稳定且足量的细胞资源是各类研究的重要基础。然而，常规细胞在传代过程中会逐渐衰老，最终失去分裂能力，这一现象被称为“Hayflick极限”（正常细胞在体外培养条件下通常只能分裂50-60次）。永生化细胞技术的出现，为科研提供了可无限传代、性能稳定的细胞。本期细胞学堂将带你快速了解永生化细胞的基本原理与构建流程，一起探索细胞研究的新边界。
01# 什么是永生化细胞
定义
永生化细胞（Cellular Immortalization）是指原代细胞在体外培养过程中，通过自发突变或外源干预手段突破Hayflick极限，从而获得可持续增殖能力的一类细胞。这类细胞通常能保留部分原代细胞的特性，在无其他致癌突变的前提下，一般不会自发癌变，但在长期培养中仍可能发生遗传变异，因此需持续监控其基因稳定性。
原理
细胞永生化主要依赖将外源基因导入目的细胞，以打破细胞衰老限制，赋予其持续增殖能力。目前常用的两类关键基因是SV40大T抗原（TAg）、人端粒酶逆转录酶（hTERT）。
01 SV40大T抗原（TAg）
目前认为，SV40大T抗原可与抑癌蛋白p53及其相关蛋白结合，形成复合体，从而使p53蛋白失活。p53的失活会阻断细胞周期调控机制受阻，导致抑癌信号失效，从而阻止细胞进入衰老或凋亡程序，促使宿主细胞获得持续增殖能力，实现永生化。
02 人端粒酶逆转录酶（hTERT）
端粒对维持染色体稳定性至关重要，其长度随着细胞分裂逐渐缩短，当缩短至临界值时，细胞将会启动衰老程序。hTERT是端粒酶的核心催化亚基，能以端粒RNA为模板合成端粒DNA以延长端粒，维持染色体的稳定性。然而，在正常细胞中，hTERT活性受表观遗传及转录调控严格抑制，无法有效维持端粒长度。因此，激活hTERT是实现细胞永生化的重要策略。
技术实现路径：
如何将“特殊指令”送入细胞？
目前，实现细胞永生化最常用的方法是通过慢病毒或其他逆转录病毒载体将编码TAg 或 hTERT 基因序列稳定整合到目的细胞的基因组中，实现持久表达。这一过程可有效打破细胞衰老机制，使细胞获得持续增殖能力，并显著延长其体外培养寿命。
关于慢病毒载体系统的优势与局限，我们在《玩转荧光标记细胞系：从原理到构建方法一网打尽》一文中进行了解读，感兴趣的读者可前往查阅。
应用领域
永生化细胞因其持续增殖能力和相对稳定的生物学特性，广泛应用于基础研究、生物医药开发及细胞工程等领域。常见应用见表1。
永生化细胞的应用（如下）
疾病模型构建：
永生化人乳腺癌成纤维细胞构建体外肿瘤微环境模型；
永生化神经元或干细胞研究神经退行性疾病或者再生医学研究
基础研究模型：
研究细胞增殖分化、凋亡及衰老机制；
设立目标提供均一的体外模型，研究肿瘤发生和进展机制
生物医药生产：
疫苗生产（如病毒疫苗）、抗体工程、重组蛋白表达；
作为稳定表达宿主，降低原代细胞获取成本
细胞治疗与基因编辑：
构建可逆永生化细胞系，用于细胞治疗前的扩增与基因修饰；
永生化CHO细胞系搭载荧光标记，控实时监控抗体/蛋白表达
药物开发与毒性评估：
用于评估致癌基因或抑癌基因突变对候选药物敏感性的影响；
筛选药物靶点，评估药物毒性
02# 永生化细胞构建简易流程
细胞系选择和状态确认
慢病毒包装细胞：选择HEK-293T，用于慢病毒的生产。应处于对数生长期且状态良好。
靶细胞：选择目标细胞，应处于对数生长期且状态良好。参考THLE-2、SV-HUC-1细胞系构建方法。
慢病毒载体制备
将转移质粒（含TAg或hTERT及嘌呤霉素抗性标记）、包装质粒和包膜质粒通过共转染技术导入HEK-293T 细胞中，制备携带目的基因的重组慢病毒颗粒。
慢病毒感染
MOI值优化：通过预实验筛选，确定兼顾较高感染效率与低毒性的最佳MOI值。
细胞培养：消化并收集状态良好的目的细胞，制成细胞悬液计数，根据浓度稀释细胞悬液至1x105/mL，取500 μL接种至24孔板中，37℃，5% CO2过夜培养。
感染操作：慢病毒置于冰上解冻，吸出原培养基后更换新的培养基，加入慢病毒（最佳MOI值），同时需要加入聚凝胺（终浓度为8 ug/mL）增强感染效率，37℃，5% CO2培养48 h。
抗性筛选
抗生素浓度梯度预实验：通过设置嘌呤霉素梯度浓度筛选出最低致死细胞浓度，作为后续筛选工作浓度。
筛选过程：感染48 h后更换为新鲜含嘌呤霉素的完全培养基继续培养，约每2-3天更换含嘌呤霉素的筛选培养基，持续培养直至稳定阳性细胞存活。
细胞鉴定
基因表达验证：采用qPCR检测永生化相关基因的表达水平。
细胞功能评估：通过β-半乳糖苷酶染色评估细胞衰老状态；连续传代细胞，动态观察其是否突破Hayflick极限。
表型稳定性鉴定：通过免疫荧光检测特异性标志蛋白的表达，评估永生化后细胞的稳定性与纯度。
03# 注意事项
1、在病毒包装过程中，核酸的质量和纯度对转染效率影响显著。建议质粒浓度控制在400-1,000 ng/μL范围内，纯度（A260/280)在1.8-2.0范围内。
2、在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，因其会显著降低病毒滴度复冻融。建议按照每次的使用量进行分装。此外，若病毒储存时间超过6个月，在使用前需重新测定病毒滴度以确保感染效率。
3、对于极难感染的细胞（如树突状细胞DC）等，可采用多次感染的方法。即感染24 h后，更换新鲜病毒进行二次感染，可显著提升感染效率。
4、永生化细胞相较于原代细胞，在增殖能力、细胞周期调控、端粒酶活性、遗传稳定性、表型和功能等方面可能发生显著改变。这些改变使得永生化细胞在实验中具有独特的优势（如无限增殖、稳定性高），但也可能限制其在某些研究中的应用（如生理条件模拟）。因此，在选择细胞模型时，需根据实验目的综合评估永生化细胞和原代细胞的适用性。
5、永生化细胞理论上可以无限传代，因为它们突破了Hayflick极限，端粒酶活性维持了端粒长度，避免了复制性衰老。但在长期传代中遗传不稳定可能导致细胞积累突变，影响其表型和功能。其次培养基成分、血清质量、传代操作等可能影响细胞状态。此外，细胞系间存在特异性，不同细胞系的稳定性不同，部分永生化细胞可能在长期培养过程中出现表型衰退或特性改变的情况。
以上是关于永生化细胞的基本原理与构建流程的详解。为帮助大家更好地开展相关研究，普诺赛®提供了原代永生化细胞及其完全培养基，一站式培养细胞，助您科研无忧！更多细胞培养干货，请持续关注细胞学堂专栏~
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