支原体污染防治全攻略：潜伏的"头号公敌"，三步精准清除！

在细胞体外培养中，污染如同潜伏的“隐形杀手”，时刻威胁着实验的准确性与稳定性。在最常见的三大污染源——支原体、细菌和真菌中，支原体污染以 30%-60% 的超高污染率，成为科研人员最头疼的难题之一。本期细胞学堂，我们将全方位解析支原体污染的防治要点，助你轻松应对这一实验室“顽疾”，为细胞培养实验保驾护航。

一、什么是支原体？

支原体（Mycoplasma），又称霉形体，属于柔膜体纲（Mollicutes），是目前已知的最小的原核生物之一。其结构由脂蛋白膜、核糖体和圆形双链DNA组成（图1），基因组大小为580-2,200 kb。

支原体虽可在无生命培养基上生长，但其生物合成能力有限（如无法自主合成胆固醇等物质），必须依赖外源营养成分的补充。细胞培养体系为其提供了适宜的生长条件，是支原体繁殖的理想环境。此外，支原体还可以附着于宿主细胞表面长期繁殖并存活。同时，由于支原体对多种常见抗生素具有耐药性，这也为其在细胞培养过程中滋生并引发污染埋下隐患。

图1. 支原体模式图

 

二、支原体污染的表现

自然界中支原体种类超过120种，而细胞培养中常见污染菌株主要包括牛精氨酸支原体、发酵支原体、猪鼻支原体、人口腔支原体、牛无胆甾支原体等。这些菌株污染细胞后，会引发细胞一系列特征性改变，包括：

1、细胞生长速率异常，增殖减慢或停滞；

2、形态改变，贴壁细胞贴壁性变差、易脱落；

3、染色体数目或结构异常，核型不稳定；

4、细胞膜抗原性改变，细胞黏附能力异常；

5、代谢通路紊乱，糖酵解、氨基酸代谢速率变化；

6、细胞复苏后存活率降低。

这些变化缺乏特异性，但会干扰细胞正常生理状态，导致实验结果失真甚至错误。由于支原体的直径仅0.1-0.3 μm，远小于常规细胞，且无细胞壁，折光性极低，因此难以通过普通光学显微镜识别。加之其对青霉素等常用抗生素具有耐药性，进一步增加了污染检测和清除的难度。因此，上述细胞表型的异常改变往往成为污染的早期预警信号—— 当细胞出现不明原因的生长或形态异常时，需优先排查支原体污染可能。

三、支原体污染检测

精准检测是防治支原体污染的关键。当前常见的支原体检测方法包括观察法、培养法、免疫法、DNA荧光染色法、分子法和发光法（表1）。其中，培养法和DNA荧光染色法是《中国药典》推荐的支原体污染检测方法。培养法是检测支原体的金标准，但操作周期长，而qPCR是灵敏度最高的支原体快速检测方法。

表1. 支原体检测方法对比

类型	检测方法	周期	成本	灵敏度	易操作性	结果判定	备注
观察法	电子显微镜观察法	-	高	非常高	扫描电镜操作相对简单，透射电镜操作复杂	扫描电镜可以观测到细胞膜上的支原体颗粒，透射电镜可以观测到支原体结构	设备昂贵，不适用于常规筛查
培养法	-	1-2月	低	非常高	低	支原体菌落	中国药典推荐
免疫法	ELISA法	3-4小时	中等	较低	一般	酶标仪检测OD值	依赖抗原抗体反应
	免疫荧光法	2-4小时	中等	较高	一般	荧光显微镜观察	依赖抗原抗体反应
DNA荧光染色法	DNA荧光染色法	1-2小时	较低	一般	高	核外荧光颗粒	中国药典推荐
分子法	普通PCR	2-3小时	中等	较高	一般	电泳条带	定量检测
	qPCR	2-4小时	高	非常高	低，操作步骤繁琐	Ct值分析	快速、灵敏、特异性高
	环介导等温扩增（LAMP）	＜1小时	较低	高	高	颜色判定	适合现场检测，易假阳性需验证
发光法	-	＜1小时	中等	高	高	酶标仪检测OD值	ATP代谢依赖，快速有效

 

四、支原体清除方法

在细胞培养过程中，发现支原体污染后，及时有效的清除至关重要。支原体清除的核心是破坏其脂蛋白膜结构、抑制关键代谢途径（如蛋白质或DNA合成）。由于支原体与细胞在培养特性上相似，如何在清除支原体的同时保持细胞的活性是很大的挑战。

01 热处理法

支原体的耐受温度范围在35-37℃，将污染的细胞置于41℃处理5-10 h（最长不超过18 h），可以杀灭支原体。但不同的细胞对高温的耐受程度不同，此方法可能损伤细胞，需要慎重使用。

02 抗生素法

支原体对部分抗生素（如卡那霉素、庆大霉素、多西环素、四环素、环丙沙星等）具有一定的敏感性。将细胞培养在含抗生素的培养基中传代培养，连续多次检测支原体为阴性，即清除成功。但过度使用抗生素可能诱导耐药或毒性反应，需谨慎操作。

03 复合型支原体清除试剂

推荐使用复合型支原体清除试剂，其通常含有抗生素和支原体脂蛋白膜穿透剂，能破坏支原体的脂蛋白膜、干扰其代谢途径、抑制DNA复制，从而达到清除支原体的目的。推荐产品：普诺赛Anti-Myc 支原体清除试剂（货号：P-CMR-001）。按照说明书将适量试剂加入细胞培养基孵育，即可清除支原体。该方法操作简便、效果显著，且对细胞的毒性相对较小，能较好地保持细胞的活性。

对清除支原体后的细胞，需通过 qPCR、DNA荧光染色等方法进行检测，确认支原体是否已被完全清除，避免试剂残留或支原体复苏导致假阴性结果。

支原体虽小，却是细胞培养中破坏性极大的污染源。唯有了解其特性、及时发现污染信号，并掌握合适的检测与清除手段，才能真正守护细胞实验的可靠性与稳定性。

以上是关于支原体污染防治的全攻略。更多细胞培养干货，请持续关注细胞学堂专栏~

 

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