解锁“宝藏”间充质干细胞：高效培养与稳定扩增指南

间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell，MSCs）是一群成体干细胞，凭借独特的生物学特性和治疗潜能，已成为疾病研究领域的“新星”。截至2024年5月，全球范围内基于MSCs的在研临床试验已超1,200项，且超过27种MSCs相关产品获批，其临床应用价值已得到初步验证。

为帮助大家快速、系统地掌握MSCs关键知识，小普规划系列推文，依次介绍：MSCs概述、体外培养与扩增、三系分化和细胞治疗。本期细胞学堂聚焦于如何高效、稳定地体外培养和扩增MSCs。

一、MSCs培养核心挑战

MSCs是贴壁生长的成体干细胞，对环境高度敏感。体外培养过程中常面临以下挑战：

1.增殖受限与细胞衰老

在体外传代过程中，MSCs会逐渐积累DNA损伤并伴随端粒缩短，从而诱发细胞衰老。

2.干性维持困难

传代次数增加导致MSCs逐渐丧失多向分化能力和增殖潜能，因此需要严格监控传代次数，以维持MSCs的生物学特性和功能稳定性。

3.细胞异质性显著

除了培养过程中内在的衰老和干性下降，不同来源（骨髓、脂肪、脐带等）的MSCs在增殖速率、贴壁能力和分化潜能上存在差异，需针对性优化培养条件。

二、MSCs培养方案

合理的培养体系是MSCs体外培养的核心因素，既要促进增殖，又要维持干性和功能特性。 目前有传统培养体系和无血清培养体系。

1. 传统培养体系

传统培养体系由基础培养基、胎牛血清及必要的生长因子构成，是实验室常用的MSCs培养体系。

• 基础培养基：α-MEM、DMEM高糖、DMEM低糖等，可为MSCs提供氨基酸、糖类和矿物质等基础营养支持。

• 胎牛血清：富含多种生长因子、激素和粘附因子，促进MSCs贴壁和增殖。普诺赛^®提供间充质干细胞专用胎牛血清。

• 生长因子：MSCs在体外传代过程可能会进入增殖停滞期，添加生长因子可激活相关信号通路。常用的细胞因子包括 FGF-2、EGF、PDGF等。

普诺赛^®推出系列间充质干细胞完全培养基，包含细胞生长所需的各种成分，无需添加任何成分，可直接用于间充质干细胞的体外培养。

2. 无血清培样体系

无血清培养基成分明确，稳定性高，批间差异小，无动物源成分带来的风险，可有效降低实验结果的干扰因素，可用于多种来源的人类间充质干细胞培养。

普诺赛^®提供无血清培养基，具体选型可根据实验需要可选择：

• 人MSCs无血清培养基（货号：CM-SC01）

• 人MSCs无血清培养基（含血替）（货号：CM-SC02）

3. 辅助试剂

在MSCs体外培养中，合理选择和使用辅助试剂，可显著提高细胞存活率、贴壁效率和干性维持。

A.抗生素

抗生素可有效防止细菌或真菌污染，常用的为青霉素-链霉素。然而，长期依赖抗生素可能掩盖低度污染或影响细胞功能，应谨慎使用。

B. 包被试剂

使用胶原蛋白、纤维连接蛋白、明胶等涂层可增强MSCs贴壁能力，尤其对初代或低密度MSCs尤为重要。在无血清或低血清培养条件下，包被试剂的作用更加明显，可有效改善 MSCs 的存活率和培养稳定性。选择包被材料时，应结合培养基类型、实验目标及后续应用（如干性维持或分化实验）进行优化。

C. 消化液

在MSCs传代中，应选用重组胰蛋白消化液和Accutase酶等温和、高效的消化液，尽量保护细胞活力、表面标记和干性特征。

对于无血清或无动物源培养体系，需使用明确标注为无动物源的消化液，以保证MSCs后续应用可靠性。

三. MSCs传代技巧

针对MSCs在体外培养中的敏感性与传代限制，严格把控以下要点可显著提升细胞质量：

1. 控制传代代次

MSCs的增殖能力并非无限。随着传代次数增加，其增殖能力、成骨分化能力等均可能下降。定期监测细胞形态、贴壁能力和生长速率以判断健康状况，发现异常应及时处理。

2. 合理控制密度

接种密度过低易导致贴壁困难，过高则诱导提前分化。一般保持70-80%融合度传代为宜。

3. 定期更换培养基

MSCs代谢活跃，代谢产物积累会改变pH，应每2-3天换液一次，保持培养环境稳定。

4. 优化消化处理

细胞消化时需注意消化酶的种类、作用时间。操作过程中应避免剧烈吹打或长时间暴露于消化酶中，以减少细胞膜损伤和表面标志蛋白的降解。

四、MSCs的鉴定方法

如何判定扩增后的细胞就是目的细胞——MSCs呢？

国际细胞治疗学会（ISCT）2006 年提出的金标准：

1、形态学观察

典型的MSCs在倒置显微镜下呈长梭形或纺锤形的成纤维细胞样外观。

人脐带MSCs 和人脂肪MSCs在人间充质干细胞无血清培养基培养传代，细胞增殖形态维持稳定（图1）。

图1. 人脐带MSCs、人脂肪MSCs不同代次细胞观察

2、表面标志物检测

表面Marker是鉴定MSCs的关键依据。

以人脐带MSCs为例，特异性Marker进行流式检测（图2）。

阳性表达（阳性率需超过 95%）：CD73、CD90、CD105、CD44。

阴性表达（阳性率不超过 2%）：CD45、CD11b、CD19、CD34和HLA-DR。

图2. 人脐带MSCs表面Marker的流式细胞术检测结果

注：不同组织来源的MSCs其表面标志物可能略有差异

3、分化功能验证

成骨、成脂和成软骨分化是鉴定MSCs的“金标准”。

大鼠骨髓MSCs分别在成骨诱导分化培养、成脂诱导分化培养、成软骨诱导分化培养基中培养，成功分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞，并分别用茜素红染色、油红O染色和阿尔（利）新兰染色鉴定（图3）。

图3. 大鼠骨髓MSCs三系分化鉴定结果

普诺赛^®曾举办《间充质干细胞成脂、成骨、成软骨诱导分化深度解析》直播课，深度解析成脂、成骨、成软骨诱导分化。感兴趣的小伙伴可以点击前往观看。

MSCs培养是一项结合科学与经验的技术活。由于其贴壁特性、环境敏感性和传代限制，MSCs培养被公认为具有一定难度，但通过合理选择培养基、添加辅助试剂和优化操作流程，完全可以降低失败率并获得高质量细胞。

以上是关于间充质干细胞体外培养介绍。后续小普还将深入探讨MSCs的三系分化、细胞疗法，帮助大家全面了解MSCs从培养到应用的全流程。

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