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公司新闻/正文
普诺赛 hUC-MSCs原代分离与鉴定全流程详解（组织贴块法）
31 人阅读发布时间：2026-09-07 17:13
2025年，国家药监局附条件批准人脐带来源间充质干细胞产品Amimestrocel Injection（睿铂生）上市，用于治疗特定类型的激素难治性急性移植物抗宿主病（aGVHD）。这一进展再次带动了大家对人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs）的关注度。
hUC-MSCs主要来源于脐带华通氏胶（Wharton's jelly），具有较强的增殖能力和多向分化潜能，同时具有相对较低的免疫原性。与骨髓、脂肪等来源相比，脐带来源具有取材方便、组织来源相对充足等特点，目前已广泛应用于再生医学、免疫调节及细胞治疗研究。
但从一段脐带获得状态稳定、纯度较高的原代hUC-MSCs，并不是简单的“剪碎—培养”。供体筛选、血液清除、血管剥离、组织贴块和早期培养条件，都会直接影响后续细胞的贴壁、增殖和表型。本期细胞学堂以组织贴块法为例，带大家梳理hUC-MSCs原代分离的关键步骤。
一、样本采集与运输
选择健康足月新生儿脐带，在符合伦理和生物安全要求的前提下完成样本采集。为保证细胞活性，采集后建议立即处理；如需运输，应置于专用的无菌保存液中低温转运，避免组织长时间处于温度异常或污染风险高的环境中。
二、样本预处理：
决定原代分离质量的第一步
①清洗与去除残留血液
在生物安全柜内，将脐带用无菌缓冲液（PBS+1%双抗）反复清洗，并用镊子轻柔挤压去除血管内残留血液。必要时可进行规范的表面消毒，如使用75%酒精浸泡消毒1 分钟，消毒完成后用缓冲液多次冲洗，避免残留成分损伤细胞。
注：残留红细胞、血小板及其他血液成分会污染华通氏胶，从而影响最终细胞活率和纯度。
②剥除脐动脉和脐静脉
将脐带剪成约6 cm的小段，纵向剪开后可见两条脐动脉和一条脐静脉。使用无菌器械仔细剥离血管，尽量保持血管组织完整和剔除干净（图1）。
注：血管组织中包含平滑肌细胞、成纤维细胞等细胞，如果剔除不彻底，后续培养过程中可能出现非目标细胞混杂，与hUC-MSCs竞争营养，甚至抑制hUC-MSCs的贴壁和增殖。
图1. 剔除干净血管后的脐带组织
③去除羊膜
用无菌镊子剥离去除脐带外层羊膜组织，保留内部华通氏胶。
注：zui大程度降低非目标组织混入，保障后续分离的hUC-MSCs纯度。
④剪碎华通氏胶
将华通氏胶剪切成大小相对均一的组织块，通常约为3-5 mm3，再用无菌缓冲液充分清洗。
注：组织块过大可能影响细胞从内部向外迁移，过小或过薄则容易在培养过程中漂浮，因此均匀、适中的组织块尺寸更有利于后续贴块培养。
图2. 撕成条状的华通氏胶（上）和剪成大小均一的组织块（下）
三、组织贴块与传代培养
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贴壁培养
将组织块均匀平铺于培养瓶底部，加入适用于hUC-MSCs培养的完全培养基，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。
组织贴块法的核心是为组织块提供稳定的贴附环境，使细胞逐渐从组织边缘迁移并贴壁。培养早期（前7天）应尽量避免移动培养瓶，待组织块稳定贴附后再进行轻柔换液。
随着培养进行，可在组织块边缘观察到逐渐迁出的细胞呈梭形或星状，可形成平行或旋涡样排列。换液后继续培养，待细胞密度逐渐增加。
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消化传代
当细胞融合度达到75%–80%时，先移除残留组织块再进行消化传代；条件允许时，回收的组织块还可进行二次贴块培养，以提高样本利用率。
图3. 接种组织块的T75培养瓶（上）和显微镜下观察从组织块迁移出的细胞（下）
四、原代分离中的关键注意事项
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供体筛选：质量控制的起点
用于研究或后续开发的脐带样本，应按照项目要求进行供体健康筛查，包括传染性疾病及相关遗传风险评估，确保样本来源符合伦理和质量规范。
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血管剥离：宁慢勿粗
脐静脉管壁较薄，操作时应避免钳尖刺破血管造成血液外渗，同时尽量完整抽离血管组织。血管去除是否彻底，是降低非目标细胞混入的重要环节。
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操作温和：减少机械损伤
剥离血管、去除羊膜及剪碎华通氏胶时应尽量减少不必要的机械损伤，同时充分清除残留血液，以降低对后续培养的影响。
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贴块稳定：前期培养尤其关键
建议选择约3-5 mm3均一的组织块，块间预留合适间距，并尽量避免培养早期移动培养瓶。若培养约7天仍未观察到明显细胞迁出，应结合组织贴附情况、样本状态及培养条件排查原因，必要时重新贴块。
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培养体系：慎用含血清的培养基
血清会促进细胞分化，对于需要维持细胞特定表型或开展功能研究的实验，建议使用经过培养验证的间充质干细胞无血清培养基。
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消化传代：酶的选择和消化时间控制并重
目前可用于hUC-MSCs传代消化的酶类主要有0.25%胰蛋白酶（含EDTA）、重组胰蛋白酶和Accutase细胞消化液。若后续涉及细胞表型、表面抗原等检测，可优先考虑相对温和的Accutase消化液或重组胰蛋白酶；若主要用于常规扩增，也可使用传统胰蛋白酶。无论选择何种消化液，都应严格控制消化程度，避免过度消化造成细胞损伤及表面抗原改变。
五、质量控制与细胞鉴定
获得细胞后，需要结合多维度指标进行鉴定是否为合格hUC-MSCs。
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形态学判定
显微镜下观察，细胞通常呈成纤维细胞样、梭形或纺锤形，并可呈平行或旋涡状排列。
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表面标志物流式鉴定
典型hUC-MSCs应高表达（阳性率≥95%）CD73、CD90、CD105等间充质干细胞阳性标志物，同时低表达或不表达（阳性率≤2%）CD34、CD45等造血干细胞及谱系标志物。
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多向分化能力
在特定的诱导条件下，细胞应具备分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的能力。
hUC-MSCs的原代分离并非简单的组织处理过程，从样本筛选、组织预处理到贴块培养和传代，每个环节都可能影响最终的细胞质量。获得细胞后，还需结合形态、表面标志物及多向分化能力进行鉴定。规范的操作流程与完善的质量控制，是获得稳定、高质量hUC-MSCs的基础，也为后续研究与应用打下扎实基础。
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