C2C12小鼠成肌细胞培养FAQ：常见问题与解决方案指南

正在培养C2C12小鼠成肌细胞？是否曾被分化效率不稳定、突然发生的污染或莫名其妙的细胞状态不佳等问题所困扰？本篇FAQ汇总了C2C12细胞培养中最常遇到的“坑”，并提供了清晰的解决方案。无论您是新手还是希望优化流程的老手，这份干货指南都能助您有效避坑，提升实验重复性与成功率。

C2C12（小鼠成肌细胞）(STR鉴定正确) 货号：CL-0044

Q1:怎么去除死细胞？

低速离心(800rpm，离心3mim)，主要是基于细胞密度和大小进行分离，死细胞和碎片比较轻，会残留在上清，活的细胞会留在离心管底部哈。这个可以去除大部分死细胞和碎片，但不能完全去除（会有少许残留）。

Q2:有些细胞传了几代之后，突然出现了一些圆形的漂浮细胞，这是正常情况？

这个是正常的，细胞增殖是个动态的过程，每个细胞所处的状态不完全一样，这种漂浮的细胞里面可能是增殖后还未来的及贴下去的，也可能是一些衰老细胞，我们每次传代的操作多少会引起一些细胞损伤导致细胞贴壁性能减弱。只要整体细胞增殖情况正常，存在少量这种细胞，可以继续培养观察看看。

Q3:刚买回来的细胞传多少代就冻存比较好？

建议细胞买回来扩增1~2代后先冻存一管，一周后复苏看下细胞活力，确认细胞冻存条件合适后可以开始大量冻存。

Q4:哪些因素会导致细胞死亡？

有多种因素可能导致这种情况：
1. 二氧化碳浓度不正确:检查设置以确保 CO2 水平设置为适合您的细胞系的水平（通常在 5% 到 10% 之间）；经常检查线路连接是否有泄漏，避免频繁打开和关闭培养箱门。
2. 培养箱中的温度波动：使用一个好用的温度计在培养箱内部监测温度。
3. 两性霉素B或其他预防性抗生素/抗真菌药物的浓度有毒：按照推荐的浓度使用。
4. 培养箱湿度不正确：检查水盘中的水位，湿度对于许多细胞和培养基而言至关重要，通常我们需要保证培养箱时刻有水，也就是饱和湿度。
5. 培养基的渗透压不正确：大多数哺乳动物细胞可以耐受 260 至 350 mOsm/kg 的渗透压，过量添加某些试剂和药物可能会影响渗透压。
6. 微生物污染：细菌和真菌污染通常很容易看到；支原体污染的症状比较难辨别，需要仔细监测细胞形态并定期进行检测以及早发现污染。
7. 使用了不适当的培养基：确认所使用的培养基适用于您的细胞类型；需确认是否含有血清及必须营养成份、是否缺少某些微量元素成份、是否含有其他添加剂及药物、培养基是否过效期、培养基保存方式是否得当。

Q5:你们实验室有没有验证过C2C12细胞成肌管实验？

测试过，普诺赛实验室分别用2%、4%、6%的马血清诱导C2C12细胞3~7天，均出现明显的肌管，其中6%马血清诱导会更快出现肌管，使用的马血清货号：164215。实验存在很多影响因素，我们总结了下面几点影响实验成败的因素： (1)细胞传代密度控制，C2C12细胞增殖较快，建议70~80%密度进行传代，每次都让细胞长得过满可能会影响后续诱导实验。 (2)马血清品质和浓度，不同品牌、批次的马血清对C2C12诱导的效果差异明显，马血清诱导浓度一般在2~10% 。 (3)诱导前细胞密度控制，我们验证了细胞70%密度开始换马血清进行诱导，效果良好。 (4)器皿贴壁性，不同器皿贴壁性存在差异，为了确保细胞诱导过程中的贴壁状态，建议使用贴壁性较好的器皿，或者使用0.1%明胶包被器皿使用。 (5)诱导周期，大部分情况下，C2C12细胞会在诱导3-7天出现明显肌管，如果诱导8-10天还未出肌管，实验可能不太成功，需要重新安排实验。 (6)预防污染，细胞污染可能导致实验失败，比如细菌污染、真菌污染或者支原体污染。

Q6:C2C12细胞传代比例和消化时间如何判断？

建议传代比例控制在1：3~1:4，这样既能保证细胞有足够的生长空间，又能避免细胞生长缓慢的问题。消化时间一般为1~2分钟，但具体时间需要根据实际情况调整。消化时间不宜过长，否则会导致细胞损伤而漂浮过多。消化过程中应密切观察细胞的状态，镜下观察细胞圆缩分散，细胞开始脱落即可终止消化。如果细胞生长较快，为了避免频繁传代，可以适当降低传代密度。

Q7:为什么不能让C2C12细胞长得过满或出现堆积？

C2C12细胞生长速度较快，如果不及时传代，细胞会长满培养瓶并开始堆积，甚至成片脱落。为了避免这种情况，建议在细胞密度达到70%~80%时进行传代。

Q8:不同引种单位的同一株细胞，RRID都是一样的吗？

是的，同一个细胞系只有一个RRID。

Q9:冻存的细胞出现颜色不一致，有的红有的粉，对复苏会有影响吗？

这种情况容易在不同冻存批次间出现，与冻存细胞的密度、冻存液配方、温度导致pH变化等有关，偶尔有遇到这种情况，不是绝对性对细胞状态有影响，可以复苏看下。

Q10:培养细胞的培养瓶可以重复利用吗？

一般不建议重复利用，特别是贴壁不牢固细胞，重复利用会导致吸附性变差，漂浮增多；一个T25瓶建议使用最多不超过3次，其次需要注意无菌操作，避免污染。