大鼠肝实质细胞分离与培养指南：攻克高活性获取，构建肝脏疾病模型

在肝脏相关研究中，肝实质细胞绝对是核心功臣！作为高度分化的肝功能执行者，这类细胞不仅完整保留了体内代谢酶活性和生理功能，更在损伤模型构建、药物毒性评价以及肝脏再生机制探索等关键领域扮演着不可替代的角色，是开展相关研究不可或缺的细胞资源。然而，从肝脏组织中高效、稳定地获取高纯度、高活力的肝实质细胞并非易事。肝组织结构复杂，其中不仅包含目标肝实质细胞，还混杂着肝枯否细胞、肝星状细胞等多种非实质细胞类型。更为棘手的是，肝实质细胞本身对机械和化学刺激高度敏感，分离操作还对技能和设备要求极高，稍不注意就前功尽弃。

本期细胞学堂直击痛点，详解大鼠肝实质细胞分离、培养全流程及其在肝脏疾病模型中的应用，提供拿来即用的实操方案！

一、基本信息

细胞名称：大鼠肝实质细胞

组织来源：肝脏

细胞简介：肝实质细胞是构成肝脏组织的基本功能单位，在代谢调控、解毒转化、胆汁生成及免疫调控等过程中发挥核心作用。其状态直接关联肝脏功能稳态，病毒、药物、免疫失衡可导致肝实质细胞损伤，引发急性炎症反应；而持续损伤则会促使肝星状细胞活化，分泌过量细胞外基质，推动肝纤维化甚至肝硬化。

细胞特点：肝实质细胞属于中高度分化细胞，不可增殖和传代，生长营养需求高，在体外存活时间短。

二、分离流程

1、灌注消化

• 麻醉与固定：选取14-56日龄的Sprague-Dawley、Wistar-Imamichi等大鼠，麻醉消毒后固定于解剖板。

• 解剖：向四肢方向横向剪开皮肤并剥开皮下组织，暴露腹部和肝脏。

灌注方法：

提供蠕动泵灌流与手动灌流两种方式，可任选其一。

方式一：蠕动泵灌流

• 血管暴露与针管固定：暴露大鼠下腔静脉和肝门静脉，灌流针插入下腔静脉并固定，进液端连接装有前灌注液的容器。

• 前灌注液灌流：打开蠕动泵，以20 mL/min的速度缓慢灌入前灌注液，待肝脏充盈，剪开肝门静脉引流，直至肝组织呈蜡黄色。

• 消化液灌注：将进液端转入灌注消化工作液，以10 mL/min的速度灌注10-20 min，同时节律性挤压肝门静脉切口，肝脏表面出现龟裂状条纹，说明消化完成。

方式二：手动灌流

• 两只注射器分别吸取前灌注液、灌注消化液。

• 血管暴露与针管固定：暴露大鼠下腔静脉和肝门静脉，静脉留置针针座与装有前灌注液的注射器锥头相接，参照蠕动泵前灌注液步骤完成该操作。

• 消化液灌注：换为装有灌注消化液的注射器，继续灌注，参照蠕动泵消化液灌注步骤操作。

完成灌注消化后，转移肝脏组织至含专用清洗液的培养皿中，去除包膜与胆囊，轻轻抖动组织使肝实质细胞分散于清洗液中。

2、分离纯化

• 细胞浊液依次经100 μm、70 μm滤网过滤，去除组织碎片及大颗粒杂质。

• 细胞悬液50 g离心5 min，弃上清。使用专用清洗液洗涤、重悬细胞2-3次。

• 取细胞进行台盼蓝染色以评估细胞活率。

3、细胞培养

• 培养器皿使用包被液预处理：37℃孵育2 h以上，或者4℃孵育过夜。

• 加入促贴壁培养基，按3×10⁵ cells/cm²的密度接种。

• 细胞培养4-6 h后，用显微镜观察细胞生长形态，可见细胞呈明显的大而圆形、双核状；更换生长维持培养基继续培养。

• 细胞培养24 h后开始分化，之后会逐渐丧失肝细胞特征，形态越来越不规则。

想了解更详细步骤，请查看大鼠肝实质细胞分离培养试剂盒说明书。

三、细胞鉴定

1、形态鉴定

显微镜观察细胞呈圆形或多角形，核大而圆且居中，部分有双核或多倍体核。

2、标志物鉴定

免疫荧光染色检测肝实质细胞特异性标志物Cytokeratin-18，细胞纯度达90%（图1）。

DAPI	Cytokeratin-18	Merge

图1. 大鼠肝实质细胞免疫荧光鉴定

四、培养信息

培养基：大鼠肝实质细胞完全培养基

换液频率：每2-3天换液一次，可持续培养1周左右

生长特性：贴壁

细胞形态：上皮细胞样

传代特性：肝实质细胞不可传代，建议分离后立即展开相关实验

消化液：不可用消化酶处理

五、应用方向

1、酒精性肝病模型 ALD^[1]

原理

乙醇、LPS和棕榈酸（PA）等酒精代谢产物诱导肝细胞脂肪变性、氧化应激、炎症反应，模拟酒精性肝损伤表型。

方法

• 单培养：1-5 mg/mL乙醇和PA (400 uM）培养基培养24 h，可诱导肝实质细胞脂肪变性。

• 共培养：肝实质细胞和肝星状细胞共培养，在动态/旋转培养条件下模拟肝脏微环境，观察组织修复过程。

• 微流芯片：在芯片上构建肝实质细胞-造血干细胞共培养球体。球体于含乙醇的培养基培养，构建炎症增强型酒精性肝病模型。

2、非酒精性脂肪性肝病（NASH）

原理

高糖（葡萄糖、果糖）、游离脂肪酸（FFA）、LPS诱导肝细胞脂肪变性、炎症反应及纤维化。

方法

• 单培养：细胞于高糖培养基中培养，诱导脂肪累积。

• 共培养：肝实质细胞与肝枯否细胞/造血干细胞在高糖、高脂、TGF-β或LPS条件下共培养，模拟肝纤维化和临床晚期疾病的特点^[2]。

• 类器官诱导：肝实质细胞、肝枯否细胞、肝内皮细胞和肝星形细胞无支架共培养构建hLiMTs类器官。hLiMTs类器官在含高糖、FFA和LPS的培养基中培养，可构建NASH模型，模拟脂肪变性、炎症及纤维化过程^[3]。

3、药物性肝损伤模型（DILI）

药物性肝损伤机制复杂，涉及遗传代谢和免疫应答。

方法

• 剂量依赖性模型：如对乙酰氨基酚、氨甲蝶呤通过多次药物暴露处理可诱导损失表型。

• 免疫相关毒性模型：需要联合多种非实质细胞协同作用，以维持长期稳定性。

• 构建3D肝组织：在气液界面（ALI）条件下，将肝实质细胞接种到细胞培养插入物上，构建3D肝组织，更适用于复杂药物反应评估^[4]。

 

以上是关于大鼠肝实质细胞分离培养的全流程攻略和疾病模型应用指南——精准攻克肝实质细胞高活性、高纯度获取等实验难题～

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参考文献：

[1] Zhu L, Li HD, Xu JJ, et al. Advancements in the alcohol-associated liver disease model. Biomolecules. 2022 July 27; 12 (8): 1035.

[2] Kostrzewski, T., Snow, S., Battle, A.L. et al. Modelling human liver fibrosis in the context of non-alcoholic steatohepatitis using a microphysiological system. Communications Biology. 2021 September 15;4 (1): 1080.

[3] Ströbel S, Kostadinova R, Fiaschetti-Egli K, et al. A 3D primary human cell-based in vitro model of non-alcoholic steatohepatitis for efficacy testing of clinical drug candidates. Scientific Reports. 2021; 11 (1): 22765.

[4] Holm C, Finelli J, Frare M, et al. Bioengineering of novel organotypic 3D human liver tissue model for drug-induced liver injury and toxicity studies. Frontiers in Toxicology. 2025 June 12; 7: 1574387.

[5] Guo H, Urban S, Wang W. In vitro cell culture models to study hepatitis B and D virus infection. Frontiers in Microbiology. 2023 April 5; 14: 1169770.