小鼠心脏微血管内皮细胞：分离培养全流程与应用指南

在心血管研究领域深耕的你，是不是早就把心脏微血管内皮细胞列为课题推进的必备wang牌？

它不仅是微循环稳态的守护者，其功能状态和病理层面的改变，会直接对心肌细胞产生影响。而且它还是多种毒素、炎症因子和病毒的重要作用靶点。因此，在构建心肌缺血-再灌注机制、内皮-心肌细胞旁分泌调控等体外模型时，心脏微血管内皮细胞是不可或缺的关键要素！

然而，心脏微血管内皮细胞的分离培养是块硬骨头。心脏组织结构致密、基质丰富且细胞异质性高。采用常规的消化与分离方法进行操作，常常会面临两种困境：要么细胞活性断崖式下降，要么被成纤维细胞大量混入，出现“鸠占鹊巢”的情况，导致难以获得高纯度的细胞，实验直接卡壳在起点！

本期细胞学堂对症下药，带来一套可重复性强、产量稳定的小鼠心脏微血管内皮细胞分离与培养全流程攻略，为心血管研究提供可靠的细胞获取路径。接下来就从基本信息入手，拆解这套实验方案！

一、基本信息

细胞名称：小鼠心脏微血管内皮细胞

组织来源：心脏组织

细胞简介：心脏微血管内皮细胞是构成心脏微血管腔面的单层扁平上皮样细胞，形成血管内壁。其产生和分泌的生物活性物质对维持血管张力、调节血压、抗血栓形成等有重要作用，在心脏血管疾病的发病机制中有重要病理生理学意义。此外，这类细胞对于心肌细胞的功能也具有生理和病理双重效应，主要通过分泌NO、内皮素-1、前列腺素、腺苷酸嘌呤、利钠肽以及其它物质来调节心肌细胞的活动。

二、分离流程

本方法先采用两步消化法对组织进行消化处理，再经过密度梯度离心纯化细胞，最后通过内皮细胞专用培养基培养筛选制备。

1、解剖操作

• 选取15-20日龄的昆明、C57BL/6、BALB/c等不同品系的小鼠，安le死并消毒后仰卧固定于解剖台。

• 剪开胸部皮肤和下方黏连的肉膜组织，横向剪断胸膈膜，剪断胸骨柄，完全打开胸腔，暴露出心脏。

• 剪断与心脏相连的血管，用弯镊挑出心脏，置于专用清洗液中，保持低温。

2、组织处理

• 去除组织表面血污和结缔组织（图1），并进行清洗。

• 将组织置于含小鼠心脏微血管内皮细胞完全培养基的EP管中，剪成1 mm³的小块。

• 将组织小块转移至离心管，加入清洗液，反复吹打，300 g离心1 min，弃上清，保留沉淀。

3、组织消化

• 向离心管加入专用消化液A，37°C水浴摇床，转速150 rpm，消化1 h。

• 补加专用消化液B，再次37°C水浴摇床，转速150 rpm，消化30 min。

• 消化结束后，加入专用清洗液，吹打均匀，经细胞滤网过滤，收集滤液。

图1. 剪开心脏组织上方的血管

4、组织分离

• 初次离心：将收集的滤液300 g离心5 min，弃上清，留沉淀。

• 洗涤与重悬：沉淀用5 mL清洗液重悬，再次300 g离心5 min，弃上清；用3 mL分离液A重悬，得到细胞悬液。

• 制备分层管：在新的15 mL管中加入5 mL分离液B。

• 形成分层：将细胞悬液沿管壁缓慢加入分离液B上方，形成液面分层。

• 密度离心：900 g离心15 min（升速1、降速0）。

• 收集白膜层：离心后在分离液A/B交界处有明显的微血管段组织（图2，以下简称白膜层），吸取白膜层转至新的离心管。

• 洗涤细胞：加入清洗液重悬白膜层细胞，300 g离心5 min，弃上清，留沉淀。

图2. 细胞经分离液纯化后图

A：细胞经分离液纯化后实拍图；B：细胞经分离液纯化后示意图

5、细胞培养

• 培养器皿包被：向T25培养瓶中加入细胞铺板工作液，37°C孵育0.5-2 h。

• 细胞接种：将小鼠心脏微血管内皮细胞接种于包被好的T25瓶，接种后可见明显的微血管段组织（图3）漂浮。

• 细胞换液：37℃，5% CO₂条件下培养48 h后，贴壁细胞上方可以看到大量的死细胞、碎片、红细胞等。缓慢吸弃上清，用PBS轻柔润洗并拍打T25瓶底使杂物脱落，弃PBS后加入新鲜完全培养基；此后每2-3天换液一次。

• 细胞传代：细胞汇合度达到80-90%时开始传代。加入1 mL Accutase细胞消化液消化5 min，收集细胞悬液，300 g离心5 min后，保留细胞沉淀，用完全培养基重悬。

想了解更详细步骤，请查看小鼠心脏微血管内皮细胞分离培养试剂盒说明书。

图3. 刚接种后的细胞悬液，可见明显的微血管段组织

三、细胞鉴定

1、形态鉴定

细胞呈典型的铺路石样、多角形、梭形，细胞核大而清晰。

2、标志物鉴定

免疫荧光染色检测内皮细胞特异性标志物CD31，细胞纯度达90%（图4）。

DAPI	CD31	Merge

图4. 小鼠心脏微血管内皮细胞免疫荧光鉴定

四、培养信息

包被条件：多聚-L-赖氨酸溶液（1×）或多聚-L-赖氨酸溶液（10×）或明胶包被液（1 mg/mL）

培养基：小鼠心脏微血管内皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率：每2-3天换液一次

生长特性：贴壁

细胞形态：内皮细胞样

传代比例：1:2

传代特性：可传2-3代

消化液：Accutase细胞消化液

五、应用方向

01、心脏缺血再灌注损伤

心脏微血管内皮细胞功能障碍在急性心肌细胞死亡中发挥关键作用，是心脏缺血/再灌注损伤（IRI）的特征。心肌缺血导致内皮细胞屏障功能破坏、血管通透性增加及炎症因子释放，而再灌注则加重氧化应激和炎症反应。通过低氧-再氧化处理心脏微血管内皮细胞，可在体外模拟心肌缺血后恢复血流引发的内皮细胞功能紊乱，探究炎症反应、氧化应激、信号通路等病理机制^[1]。

02、糖尿病心肌病

心肌微血管损伤是早期糖尿病性心肌病（DCM）的关键事件。高糖高脂处理心脏微血管内皮细胞，可构建体外细胞模型^[2]，用于模拟糖尿病患者特有的一种心脏病变。有研究发现，MICU1缺乏会导致线粒体钙过度摄取和稳态失衡，引起硝化应激，造成内皮损伤和炎症，破坏心肌微血管内皮屏障功能，最终促进DCM的进展^[2]。

03、血管生成及修复研究

心脏微血管内皮细胞常用于探索心肌血管生成与修复机制。研究发现，当心脏微血管内皮细胞与心脏端足细胞（Cardiac telocyte, CT）共培养时，CT来源的细胞外囊泡中miRNA-21-5p靶向抑制p53靶基因Cdip1，下调激活的caspase-3水平，从而抑制心脏微血管内皮细胞的凋亡，促进心肌梗死（MI）后的血管生成和再生^[3]。

以上是关于小鼠心脏微血管内皮细胞分离培养的全流程攻略拆解，精准攻克心脏组织处理、细胞活性维持及纯度把控等实验难题~

更多原代细胞培养的核心技巧与实验方案，请持续关注细胞学堂专栏！

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PB180522	多聚-L-赖氨酸溶液（1×）
PB180523	多聚-L-赖氨酸溶液（10×）
PB180535	明胶包被液（1 mg/mL）

参考文献：

[1] Ma L, Zou R, Shi W, et al. SGLT2 inhibitor dapagliflozin reduces endothelial dysfunction and microvascular damage during cardiac ischemia/reperfusion injury through normalizing the XO-SERCA2-CaMKII-coffilin pathways. Theranostics. 2022; 12 (11): 5034-5050.

[2] Shi X, Liu C, Chen J, et al. Endothelial MICU1 alleviates diabetic cardiomyopathy by attenuating nitrative stress-mediated cardiac microvascular injury. Cardiovascular Diabetology. 2023; 22 (1): 216.

[3] Liao Z, Chen Y, Duan C, et al. Cardiac telocytes inhibit cardiac microvascular endothelial cell apoptosis through exosomal miRNA-21-5p-targeted cdip1 silencing to improve angiogenesis following myocardial infarction. Theranostics. 2021; 11 (1): 268-291.