肿瘤干细胞(CSCs)捕获与培养全流程指南

在肿瘤研究领域，有一类特殊的细胞扮演着“总指挥官”的角色——肿瘤干细胞（CSCs）。它们在肿瘤组织中所占比例极低，但成瘤能力较普通的肿瘤细胞高出数百倍，是肿瘤发生、发展、转移与复发的根源。如何成功“捕获”、培养并研究这类关键细胞，是推动肿瘤生物学突破和新型疗法开发的核心。

本期细胞学堂将系统梳理肿瘤干细胞的核心概念、主流诱导分离技术、肿瘤球培养扩增的策略，并展望其在前沿研究中的应用价值。

一、认识肿瘤干细胞

肿瘤干细胞，又称癌症干细胞。它并非是由正常干细胞癌变而来，而是肿瘤组织中存在的一小部分具有自我更新并驱动肿瘤异质性和持续扩增的细胞亚群^[1]。它们具备两大核心能力：

1. 自我更新：肿瘤干细胞能够通过分裂产生与自身相同的子代细胞，也就是子代肿瘤干细胞（CSCs），从而维持“种子库”的长期稳定存在。

2. 多向分化潜能：肿瘤干细胞可以分化产生肿瘤内所有异质性的细胞类型，构成肿瘤的“主体部队”。

如果将肿瘤想象成一棵不断生长的“恶树”，肿瘤干细胞就是深埋的“树根”，而大量分化形成的肿瘤细胞则是“枝叶”。传统的放疗和化疗手段可以轻松砍掉“枝叶”，使肿瘤体积缩小，但却难以彻底清除“树根”，这正是许多肿瘤在治疗后出现耐药并发生复发的重要原因之一。

二、如何“捕获”肿瘤干细胞？

获取肿瘤干细胞是开展相关研究的首要步骤。主要策略分为体外诱导和直接分选两大类。

1、体外诱导法

基于肿瘤细胞系具有一定的可塑性，我们可以通过模拟特定应激环境，诱导部分非肿瘤干细胞发生去分化，让它们重获干细胞特性。不过，诱导后的细胞还需要进一步分选，并通过功能性实验进行验证。

无血清培养法

在无血清培养体系中添加特定的生长因子（如EGF、bFGF），从而富集具有自我更新能力的细胞。

低氧诱导法

在低氧（1-3% O₂）条件下对肿瘤细胞进行培养，模拟肿瘤内部微环境。在这种环境下，多种干细胞相关基因（如OCT4, NANOG）的表达会上调。不过，这种方法对设备和氧浓度稳定性要求较高。

化疗药物耐受筛选法

用低剂量的化疗药物（如顺铂、紫杉醇）长期持续处理肿瘤细胞系，经过一段时间后，存活下来的细胞群体往往是富含有强耐药性的肿瘤干细胞。但需要注意的是，该方法需结合功能性实验验证，排除普通耐药性细胞，以确保筛选结果的准确性。

2、直接分选法

直接分选法是一种更直接、常用的肿瘤干细胞富集策略。先将肿瘤组织制成高质量单细胞悬液，并根据 肿瘤干细胞的表面标志物或功能特性进行物理分离，其中流式细胞术分选被公认为是金标准。

表面标志物分选

不同实体肿瘤的肿瘤干细胞标志物具有肿瘤类型特异性^[1-2]，具体选择哪些标志物作为指征需查阅文献确定。可通过流式细胞术和磁珠分选的方法来实现表面标志物的分选，不过分选效果高度依赖抗体的特异性。

侧群细胞分选^[2]

基于肿瘤干细胞能将Hoechst 33342染料泵出细胞的特性进行分选。虽然该方法无需已知特异性标志物，但染色和检测条件需严格优化，并且仅适用于流式分选。

磁珠分选

通过磁珠标记抗体对细胞进行阳性或阴性分选。这种方法操作相对简单，仪器成本低，适用于大体积样本的初步富集，但分选得到的细胞纯度通常低于流式分选。

三、肿瘤干细胞的培养与扩增

由于肿瘤干细胞具有在无血清、非贴附条件下自我更新并形成3D球体的能力，成球实验被公认为是目前体外评估肿瘤细胞干性最常用、最可靠的金标准方法之一。超低吸附培养是最经典、最常用的肿瘤球培养方法。具体操作时，可使用未经组织培养处理的塑料器皿（如超低吸附培养板），或经多聚物（如Poly-HEMA）包被的器皿，这些特殊处理的器皿能抑制细胞贴壁生长，促进细胞聚集，进而形成悬浮的球体（图1）。

当肿瘤球的直径过大时，球体核心会因缺乏营养和氧气而逐渐坏死。因此，需在球体致密、大小均一时进行传代处理。传代时常用Accutase消化液或胰酶-EDTA温和消化肿瘤球，获得高质量单细胞用于下次接种。传代时的接种密度是至关重要的，密度过高球体易融合，密度过低则难以成球。建议进行密度梯度接种测试，选择合适密度进行实验。

图1. 肿瘤干细胞成球（A：HCT 116；B：SUM159PT）

四、从实验室到前沿应用

稳定构建肿瘤干细胞(CSCs)肿瘤球，可以为肿瘤研究从基础机制探索到临床转化提供有力工具。

01、药物筛选与耐药性研究

传统的二维（2D）筛选方法，主要针对的是只能杀死快速增殖的“枝叶”细胞，而三维（3D）肿瘤球筛选能评估药物对CSCs“根”的杀伤效果，以及药物在球体内部的渗透能力。通过检测球体大小、活力以及干细胞标志物的表达变化来综合评估药效。

02、肿瘤发生与演进机制研究

通过添加不同细胞因子或使用小分子抑制剂来调控培养条件，动态观察CSCs分化轨迹。

将肿瘤球嵌入基质胶，可直观观察细胞从球体边缘向周围基质侵袭的“微转移”过程。

03、个性化医疗与精准治疗

从患者的肿瘤组织中分离培养CSCs并构建肿瘤球，可用于体外药敏测试，为复发或者难治性患者筛选出更有效的化疗方法或靶向药物组合。

通过对比不同患者来源CSCs的基因和蛋白表达谱，寻找新的治疗靶点和预后标志物。

04、肿瘤微环境相互作用研究

通过将CSCs与肿瘤相关的成纤维细胞、免疫细胞等进行共培养，构建更复杂的类器官模型，用于研究微环境中CSCs的干性维持和免疫逃逸等关键调控机制。

以上是关于肿瘤干细胞的核心技术与应用方向，助力攻克相关实验卡点！

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参考文献：

[1] Herreros-Pomares A. Identification, culture and targeting of cancer stem cells. Life (Basel). 2022 Jan 27;12(2):184.

[2] Teoh PL, Saini N. Biomarkers, isolation methods, and therapeutic implications of breast cancer stem cells. Cancer Pathogenesis and Therapy. 2025;3(5):392-401.