T细胞养不好？体外培养指南来了，实验操作要点一篇讲清

T细胞是适应性免疫系统中的核心效应细胞，主要负责识别并清除体内的病原体、癌细胞及异常细胞，并维持免疫系统的平衡。其典型表型为CD3⁺，根据功能主要分为以下亚群：

在体外条件下，静息T细胞无法自行增殖，其经典激活依赖三类信号：

• 第一信号（抗原识别信号）：T细胞膜上的抗原特异性T细胞受体（TCR/CD3）与抗原呈递细胞（APC）上的抗原肽-MHC分子复合物的相互作用，实现抗原特异性识别。

• 第二信号（共刺激信号）：T细胞表面CD28分子与APC表面相应配体B7-1（CD80）和B7-2（CD86）的结合，形成共刺激，激活T细胞，增强免疫应答。

• 第三信号（细胞因子信号）：IL-2等细胞因子与T细胞上其受体等结合，持续刺激T细胞激活、增殖。

在体外培养体系中，通常采用CD3/CD28抗体联合IL-2模拟上述信号，实现T细胞的有效激活。

①将外周血用PBS按1:1比例稀释后，铺于Ficoll分离液上方，2,000 rpm离心20 min（升速1降速0）。

②离心结束后可见明显分层（图1），位于分离液层和血浆层中间的细胞层是PBMC层。

③吸取PBMC至新离心管，用PBS清洗2-3次。

图1.Ficoll分离液分离前后示意图

T细胞富集常用磁珠分选法，通过识别T细胞表面CD3或者其他特异性标志物，筛选目标细胞；或通过标记非目的细胞，磁珠分离去除非目的细胞，从PBMC中富集高纯度T细胞。

需注意，磁珠分选前PBMC需保持良好的单细胞分散状态。若出现细胞团聚，可采用移液枪轻柔吹打分散，再经200目滤网过滤，去除细胞团块和杂质，以提高分选效率和细胞纯度。随后对细胞悬液进行计数，参考分选磁珠说明书将细胞浓度调整至适宜范围，再展开分选操作。

分选所得T细胞处于静息状态，无增殖能力，需经体外激活诱导，方可进入快速扩增状态。

T细胞激活常用方式主要分为可溶性抗体法与抗体包被法两种。

可溶性抗体法：向培养基内加入可溶性CD3、CD28抗体，再接种T细胞培养2-3 d，之后更换新鲜培养基继续培养。

抗体包被法：采用CD3、CD28抗体包被培养板，置于4℃冰箱过夜孵育；随后清洗培养板2-3次，加入培养基并接种T细胞2-3 d，再转移至未包被培养板继续培养。

培养过程中通常需要额外添加IL-2，以维持T细胞的持续扩增。

推荐使用人外周血CD3+T细胞（抗体-细胞因子激活扩增）完全培养基，使用过程中无需额外补充IL-2。

T细胞培养周期14 d左右，期间可以扩增数十至数百倍。

培养过程中，需每2-3 d补充一次培养基，将细胞密度维持在1×10⁶个/mL左右，防止因细胞密度过高导致细胞死亡。

同样推荐使用人外周血CD3+T细胞（抗体-细胞因子激活扩增）完全培养基，使用过程中无需额外补充IL-2，可满足T细胞体外扩增的需求。

T细胞激活扩增后，需对其纯度及活化状态进行鉴定。通过显微镜观察激活后T细胞形态，并采用流式细胞术鉴定（图2）。结果显示，T细胞形成明显细胞聚团并进入活化增殖状态，CD3阳性率达99%。进一步检测T细胞活化相关表面分子CD69与CD25的表达情况，结果显示CD69阳性率较低，CD25阳性率较高，提示T细胞已由早期活化阶段逐渐进入持续活化与增殖状态（图3）。

图3.T细胞活化标志物CD25/CD69流式细胞术检测

T细胞离心后使用含有10%DMSO的冻存液重悬细胞，调整细胞浓度至1×10⁶/mL-1×10⁷/mL的密度。

分装至冻存管，进行程序降温。-80℃冻存过夜后转移至液氮长期保存。

在复苏时，应提前将水浴锅预热至37℃，预热完全培养基。

将裹着手套的冻存管在水浴锅中迅速摇晃、溶解后，立刻将细胞转移至装有5mL预热好的培养基的15mL离心管。

离心去上清，用完全培养基重悬细胞。

接种至准备好的培养皿内，放入37℃、5% CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中静置培养。