细胞学堂｜原代永生化细胞实操手册：培养、冻存、复苏全攻略

原代永生化细胞培养的核心是“模拟体内环境”，为细胞提供适宜的营养和生长条件。细胞接种、培养基更换和细胞传代是最基础且关键的操作步骤。

细胞接种是细胞培养的第一步，合理的接种密度和均匀分布有助于细胞快速贴壁和稳定生长。

操作步骤

• 将复苏后的细胞或传代后的细胞悬液，1,000 r/min 离心5 min，吸弃上清液。

• 加入适量的37℃预热的完全培养基，轻轻吹打混匀，制成单细胞悬液。

• 先吸取一定量完全培养基于培养瓶中，按照计算的接种密度（通常1×10⁵-1×10⁶个/mL），吸取相应体积的细胞悬液，沿壁加到培养瓶中，并吹打混匀，最后加培养基到该培养器皿推荐的加液体积。

• 轻轻摇晃培养瓶，使细胞均匀分布在瓶底，避免细胞堆积。

• 将培养瓶放入37℃、5%CO₂培养箱中，静置培养24-48 h，期间尽量不要移动培养瓶，让细胞充分贴壁。

随着培养时间延长，培养基中的营养物质会逐渐消耗，同时细胞代谢产生的废物不断积累，因此需定期更换培养基，通常每2-3 天换液一次。

操作步骤

• 在超净工作台中拿起培养瓶，轻轻倾斜，使培养基集中在瓶底一侧。

• 用移液枪缓慢吸弃旧培养基，避免吸到贴壁细胞。

• 加入适量的37℃预热的PBS，轻轻摇晃培养瓶，使瓶底残留的旧培养基及代谢废物混匀，再吸弃上清液（首次换液可重复此步骤）。

• 加入适量新鲜预热的完全培养基，放回培养箱继续培养。

当细胞汇合度达80%-90%时，应及时进行传代。

操作步骤

• 吸弃培养基，用PBS轻轻润洗瓶底2次，去除残留培养基（血清会抑制消化酶活性）。

• 加入适量消化酶（刚好覆盖瓶底即可），37℃孵育1-3 min。

• 在显微镜下观察，当细胞逐渐变圆并开始脱离瓶底时，根据所消化酶类型进行处理：

  ◆对于胰蛋白消化酶：立即加入3-5倍含血清的培养基或者胰蛋白酶抑制剂，终止消化反应。

  ◆对于部分温和消化酶（如 Accutase等）：无需专门终止反应，可直接进行后续操作。

• 用移液管轻轻吹打瓶底，使细胞完全脱落，制成单细胞悬液。

• 将细胞悬液1,000 r/min离心5 min，弃去上清液。

• 加入新鲜培养基重悬细胞，按比例（通常1:2-1:4，以说明书为准）接种到新的培养瓶中，继续培养。

• 消化时间不宜过长，避免过度消化损伤细胞。

• 吹打细胞时动作要轻柔，减少机械剪切损伤。

• 对于贴壁能力较弱的细胞，若需接种至玻璃爬片、培养板或共聚焦培养皿等实验器皿，建议提前进行基质包被（如胶原蛋白或多聚赖氨酸等），以增强细胞贴壁能力。

细胞冻存是长期保存细胞的重要方法。通常选择生长状态良好、汇合度达80%-90%的细胞进行冻存。

• 冻存前 24 h 内更换一次培养基。

• 收集细胞，制备成单细胞悬液，细胞活率 > 90%。

  ◆贴壁细胞：按照传代方法，消化并离心，收集细胞沉淀。

  ◆悬浮细胞：直接离心收集细胞沉淀。

• 将细胞悬液 1,000 r/min 离心 5 min，弃上清。

• 向细胞沉淀中加入预冷冻存液，轻轻吹打混匀，使细胞浓度达到2-5×10⁶- 个/mL。推荐产品通用血清型程序冻存液。

• 将细胞悬液分装到冻存管中（每管0.5-1 mL），拧紧管盖，做好标记（细胞名称、冻存日期等）。

• 按细胞冻存程序性降温步骤冻存细胞（4℃，30 min；-20℃，1-2 h；-80℃，过夜）。

• 若需长期保存，可在 −80℃冻存过夜（>16 h） 后转移至液氮罐中保存。

• 建议正式冻存前进行至少1周的冻存测试实验。

• 梯度降温可使用程序降温盒，操作更便捷，细胞存活率更高。

复苏是冻存的逆过程，核心原则是“快速解冻、减少损伤”。

• 提前将复苏用培养基放入37℃水浴锅中预热，准备好培养瓶和离心管。

• 从液氮罐中取出冻存管，放入PE手套中，迅速放入37℃水浴锅中，快速摇晃冻存管，使细胞悬液在1-2 min内完全解冻。

• 将解冻后的细胞悬液转移到含3-5倍体积的预热培养基离心管中，轻轻吹打混匀，1,000 r/min离心5 min，弃去上清液。

• 用适量完全培养基重悬细胞，并接种到培养瓶中，补充培养基到适宜，放入培养箱中培养。

• 解冻后的细胞活性较弱，接种密度可适当提高。

• 复苏后24 h内尽量不要移动培养瓶，让细胞充分贴壁。

• 若细胞存活率较低，可适当增加血清浓度，帮助细胞恢复。

原代永生化细胞的培养、冻存与复苏，看似简单，但每个环节都直接影响细胞状态。规范的无菌操作、温和处理方式和稳定的培养环境是保证细胞活性的重要基础。