细胞学堂|把控外泌体上游，从源头减少样本结果偏差！

外泌体（exosome）是细胞外囊泡（small extracellular vesicles，sEV）的重要组成部分，是由细胞分泌形成的纳米级双层膜囊泡，粒径通常集中在30-150 nm。凭借其在细胞间通讯、分子递送以及疾病诊断等方面的重要作用，外泌体已成为再生医学、液体活检和药物递送等领域的核心研究热点。

随着研究的不断深入，研究人员逐渐认识到，外泌体的样本质量不仅取决于后续纯化与鉴定技术，上游细胞培养过程也同样会影响外泌体的产量、组成以及生物学功能。根据国际细胞外囊泡学会（International Society for Extracellular Vesicles, ISEV）发布的MISEV2018^[1]和MISEV2023^[2]指南，外泌体研究需要建立标准化制备流程，其中细胞来源、培养体系、培养模式以及上清收集条件均是影响样本质量的重要因素。因此，建立规范化的上游生产流程，是获得稳定、高质量外泌体样本的核心基础。

本期细胞学堂将聚焦外泌体生产的上游全流程，从种子细胞选择、培养基体系、培养模式到上清收集与预处理，逐一拆解那些容易被忽视却至关重要的关键节点，帮助您避开常见“雷区”。

外泌体的细胞来源十分广泛，包括间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）、HEK293细胞、免疫细胞以及肿瘤细胞等多种细胞。其中，人脐带沃顿胶间充质干细胞（Human Wharton’s jelly-derived MSCs，hWJ-MSCs）因具有增殖能力强、分泌水平高以及免疫原性低等特点，成为外泌体研究中的常用细胞之一。

需要注意的是，外泌体组成并非固定不变，会受细胞状态和培养环境的影响。同一细胞类型在不同培养条件下产生的外泌体，其蛋白质、miRNA及脂质谱也可能存在差异，最终影响其生物学功能的一致性。

因此，在外泌体制备过程中，应关注细胞来源、传代次数以及培养状态。以MSCs为例，随着传代次数增加，细胞可能出现增殖能力下降、衰老比例升高以及外泌体分泌水平变化等问题。同时，配套开展细胞种属鉴定、支原体检测等质控措施，保证不同批次外泌体样本的稳定性。

培养基的选择直接决定了体系中外源杂质的占比，也是实验操作中最易引入偏差的环节^[3]。常规胎牛血清（FBS）中本身含有大量牛源外泌体与脂蛋白，若直接用于外泌体富集阶段的条件培养，会严重干扰后续实验结果。目前行业内主流的解决方案包括三种：

①去外泌体血清培养体系：通过超速离心、膜过滤等工艺去除血清中绝大部分内源性外泌体。直接使用商业化的去外泌体血清配制完全培养基进行细胞培养，操作简便，可满足常规基础科研需求；受现有去除工艺限制，体系中仍可能存在极微量的外泌体残留。

②使用无血清限定培养基：采用化学成分明确的无血清培养基，完全不添加动物源成分，从根源上避免了动物源外泌体与杂蛋白污染，是符合GMP生产的标准方案，但需重点关注部分细胞在长期无血清培养环境下易发生凋亡，产生的凋亡小体会大幅降低最终外泌体的纯度。

③PBS洗涤转无血清培养：在使用常规含血清完培培养扩增后，用PBS充分洗涤细胞2-3次，更换无血清基础培养基孵育24-72 h后再收集上清，在保障细胞活性的同时兼顾了样品纯度；充分洗涤可显著降低上清中残留的可溶性蛋白与游离外源囊泡，是后续提升外泌体纯化效率的重要前提。

实验室常规外泌体制备通常采用培养瓶或培养皿进行二维培养，该方式操作简单，适合小规模研究。

随着外泌体研究逐步向动物体内实验、临床转化阶段推进，传统二维培养逐渐面临培养面积有限、产量不足以及批次间操作差异明显等问题。因此，生物反应器体系逐渐应用于规模化生产，如微载体反应器、中空纤维反应器以及固定床反应器等。其中，中空纤维反应器可实现细胞高密度培养，同时降低机械剪切影响，有助于维持细胞状态并提高外泌体生产效率。

无论采用何种培养模式，细胞状态的精准把控始终是关键。通常情况下，在细胞汇合度达到70%–80% 时进行条件培养，有利于获得稳定样本。汇合度过高会导致接触抑制与代谢废物堆积，汇合度过低则会导致上清中外泌体浓度不足，影响纯化回收率。

细胞培养上清是外泌体的直接来源载体，上清的收集与预处理是连接上游生产与后续纯化的重要环节。在收集过程中需严格控制条件培养的时长，避免培养时间过长导致细胞状态下降和凋亡比例上升。建议在细胞状态稳定阶段完成上清收集，以减少非目标囊泡和细胞碎片产生。

收集后的培养上清，通常需要梯度离心完成预处理：

• 300×g离心10 min，去除体系中残留的完整活细胞；
• 2,000×g离心20 min，去除死细胞与细胞碎片；
• 10,000×g离心30 min，去除大粒径囊泡及蛋白聚集体。

完成预处理的样本应根据后续实验需求进行保存。需要注意的是，反复冻融可能导致外泌体膜结构破坏、颗粒聚集以及功能活性下降，因此应尽量减少样本的冻融次数。部分研究会选择增加0.22 μm滤膜过滤步骤，操作前需提前评估滤膜材质、蛋白吸附以及过滤过程中的囊泡损失。