外泌体纯化与鉴定掌握这几点，高质量样本稳了

上一期我们从细胞来源、培养体系、培养模式到上清收集条件，系统梳理了外泌体制备的上游关键环节。获得培养上清后，如何从复杂体系中高效分离目标囊泡，并判断样本是否符合研究要求，则成为下游实验的关键。

细胞培养上清除含有外泌体外，还含有可溶性杂蛋白、脂蛋白聚集体、细胞碎片、凋亡小体及大尺寸胞外囊泡。纯化方法选择不当，可能造成样本纯度不足、囊泡结构破坏、生物学活性丢失，进而导致功能实验结果紊乱或组学数据背景偏高。随着ISEV发布MISEV2023指南，外泌体研究对样本纯化和多维度表征的规范性要求进一步提高，仅依赖单一纯化方法或单一指标进行鉴定已难以充分支撑研究结论^[1]。因此，合理选择纯化技术，并建立多维度鉴定与质控体系，是获得可靠外泌体的关键。

 

一、纯化技术怎么选？关键看分离原理

外泌体纯化的核心原理，是基于囊泡独特的物理与生化特性，包括30-150 nm粒径区间、1.13-1.18 g/mL密度特征以及CD9、CD63、CD81等特异性膜标志物，实现目标组分与杂质的有效分离^[2]。目前，实验室基础研究与临床转化领域主流纯化技术包括超速离心（Ultracentrifugation，UC）、切向流超滤（Tangential Flow Filtration，TFF）、尺寸排阻色谱（Size‑Exclusion Chromatography，SEC）、聚合物沉淀及免疫亲和层析。不同技术的分离机制、样本回收率、纯度水平及囊泡活性保留能力差异显著，需根据具体研究场景合理选用^[3]。

●超速离心：经典但存在共沉淀

超速离心利用不同颗粒沉降特性的差异，通过逐级增加离心力去除细胞及碎片，并在100,000×g左右富集囊泡。该方法无需额外化学试剂，适用于实验室常规样本及较大体积上清的初步富集。但超高离心力可能挤压囊泡造成膜损伤与颗粒聚集，脂蛋白复合物及可溶性蛋白易发生共沉淀，导致样本纯度有限；同时批次间重复性较差，难以满足临床规模化生产需求^[3]。

●TFF+SEC：兼顾纯度与规模化

TFF通过切向流循环实现样本浓缩，相较传统死端过滤可降低膜堵塞及囊泡吸附损失，并具有较好的工艺放大潜力。Visan等人研究显示，TFF+SEC在产量和纯化效率方面优于UC+SEC，更适合大体积样本处理^[4]。

对于TFF难以完全去除的同源粒径脂蛋白与小分子炎症蛋白，可通过SEC进一步精制。SEC依靠多孔凝胶填料的分子筛效应，粒径较大的外泌体无法进入填料孔隙而优先被洗脱；小分子杂蛋白、游离核酸则因进入孔隙而延迟出峰。该步骤可高效去除可溶性杂质，显著提升样本的颗粒/总蛋白比值，是提升外泌体纯度的核心精制手段之一。

●聚合物沉淀：操作简单，但纯度有限

聚合物沉淀法以PEG沉淀为代表，操作简便、设备门槛低、多种颗粒回收率较高，适于低浓度微量样本的快速富集。但该技术属于非特异性共沉淀机制，在富集外泌体的同时会大量裹挟杂蛋白、多糖及脂蛋白杂质，样本整体纯度偏低；残留的PEG分子可能持续干扰细胞孵育、蛋白电泳、体内给药等后续实验，易造成实验假阳性与结果偏差^[3]。因此，该方法更适用于前期预实验摸索，在正式机制研究与动物体内功能实验中需审慎使用。

●免疫亲和层析：特异性强，但应用场景有限

免疫亲和层析通过固定化CD9/CD63/CD81等特异性抗体靶向捕获外泌体亚群，理论纯度最高，可实现特定囊泡亚群的选择性分离。但该方法成本高昂，洗脱条件可能破坏囊泡膜结构，样本损失率较高，目前多用于小众亚群机制研究，不适用于常规大批量样本制备^[2,3]。

 

二、纯化完成后，如何判断样本是否合格？

在纯化工艺完成后，规范化的多维度鉴定体系是验证外泌体样本合格性的核心依据。依据MISEV2023指南，外泌体研究应在可行范围内同时包含以下维度的表征：①颗粒浓度与粒径分布分析；②形态学观测；③蛋白标志物分型及污染评估^[1]。仅凭单一表征往往不足以支撑研究结论的可靠性。

颗粒水平表征：看粒径，更要看纯度

纳米颗粒跟踪分析（NTA）可用于检测颗粒浓度及粒径分布，是常用的颗粒水平表征方法。对于hWJ-MSC来源外泌体，应关注30-150 nm范围内的颗粒分布，同时结合颗粒/总蛋白比值评价样本纯度^[5]。

需要注意的是，粒径本身并不能证明颗粒就是外泌体。动态光散射（DLS）对复杂、异质性纳米囊泡的分辨能力有限，更适合作为辅助检测手段，不宜单独作为鉴定依据^[1]。

形态学观测：TEM与Cryo-TEM各有优势

透射电镜（TEM）可用于观察细胞外囊泡（如外泌体）的典型形态及膜结构，但传统负染、固定和干燥等过程可能导致囊泡形态改变，因此常见的“杯状”或“茶托样”形态并非外泌体天然状态，而可能与样品制备过程有关^[2]。

对于更高标准的基础研究和转化研究，冷冻电镜（Cryo-TEM）可减少固定、染色和干燥造成的人工形变，更有利于观察接近天然状态的外泌体形态。

蛋白标志物免疫检测：阳性与阴性标志物都不能少

蛋白标志物检测是判断囊泡来源及评估污染的重要环节，应同时设置阳性和阴性标志物^[1]。

阳性标志物包括经典外泌体跨膜蛋白 CD9、CD63、CD81，ESCRT通路相关蛋白TSG101、Alix，以及膜筏蛋白Flotilin等^[2]；阴性标志物可选择内质网标志物Calnexin等细胞器相关蛋白，同时可选用脂蛋白标志物APOA、APOB用于评估脂蛋白污染。若阴性标志物出现明显表达，则提示样本可能存在细胞器、细胞裂解产物或脂蛋白杂质污染，需要进一步评估纯化效果。

图1. 使用普诺赛^®微量外泌体分离试剂盒（磁珠法）(货号：P-CA-501)提取外泌体鉴定结果

 

三、从基础研究到转化研究，QC要求也在升级

如果样本进一步用于动物实验或临床前研究，除常规粒径、浓度、形态及标志物检测外，还应根据研究需求增加内毒素、无菌及冻融稳定性等质量控制项目^[1]。

尤其是体内给药样本，需要严格控制内毒素水平，避免非特异性炎症反应；同时应减少反复冻融，以降低囊泡膜结构破坏、聚集及活性下降的风险。Krishnan等以颗粒数量而非蛋白浓度作为体内安全研究的给药策略依据，系统验证了TFF 纯化hWJ-MSC外泌体在体内无显著毒性且主要分布于肝脏和脾脏，为临床转化提供了关键的安全性数据基础^[6]。

外泌体纯化并不存在适用于所有研究场景的单一最优方法。基础研究可根据样本量及实验目的选择差速超速离心等方法；对纯度和规模化要求更高的研究，可考虑TFF+SEC组合工艺；面向临床转化，则需以可放大、可标准化的工艺为基础，建立系统性的质量控制体系。

从上游培养到下游纯化，再到多维度鉴定，外泌体研究的每一个环节都可能影响最终结果。遵循ISEV相关规范，建立标准化、可重复、可追溯的制备与质控流程，才能为后续功能研究及临床转化提供更加可靠的样本基础。

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参考文献

[1] Welsh JA, Goberdhan DCI, O'Driscoll L, et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches.J Extracell Vesicles.2024 Feb;13(2):e12404.

[2] Van Niel G, D'Angelo G, Raposo G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles[J].Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2018, 19(4): 213-228.

[3] Patel G K, Khan M A, Zubair H, et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications[J].Scientific Reports, 2019, 9(1): 5335.

[4] Visan K S, Lobb R J, Ham S, et al. Comparative analysis of tangential flow filtration and ultracentrifugation, both combined with subsequent size exclusion chromatography, for the isolation of small extracellular vesicles[J].Journal of Extracellular Vesicles, 2022, 11(9): e12266.

[5] Krishnan I, Ng C Y, Kee L T, et al. Quality control of fetal Wharton's jelly mesenchymal stem cells-derived small extracellular vesicles[J].International Journal of Nanomedicine, 2025, 20: 1807-1820.

[6] Krishnan I, Vijakumaran U, Hwei N M, et al. Safety evaluation and biodistribution of fetal umbilical cord mesenchymal stem cells-derived small extracellular vesicles in Sprague Dawley rats[J].International Journal of Molecular Sciences, 2025, 26(14): 6806.