小鼠骨髓单核细胞分离培养指南-破解BMMNCs培养难题

在免疫学、造血系统、炎症调控以及再生医学研究中，骨髓单核细胞是应用极为广泛的基础实验材料。单核/巨噬细胞分化研究、造血微环境相关实验、肿瘤免疫机制与组织修复模型构建，骨髓单核细胞（Bone Marrow Monocytes）都发挥着关键作用。然而，这类原代细胞的获取并非“取材即得”。从取骨、过滤到密度梯度分离，每一步都可能影响细胞活性与纯度。密度介质如何选择？分层如何稳定？培养体系又有哪些关键参数？

本期细胞学堂，将系统梳理小鼠骨髓单核细胞分离培养流程，帮助你快速获得状态稳定、活性良好的BMMNCs，为后续功能实验奠定可靠基础。

一、基本信息

细胞名称：小鼠骨髓单核细胞

组织来源：股骨或胫骨骨髓

细胞简介：骨髓单核细胞是一类终末分化细胞，不增殖细胞群，具有分化为巨噬细胞（Macrophage）、树突状细胞（Dendritic cells，DC）或破骨细胞（Osteoclast）的潜能，是机体防御系统的重要组成部分；虽在小鼠骨髓细胞中仅约占0.04%，但具有关键的免疫调控作用。研究显示，骨髓单核细胞分化为破骨细胞的得率高于外周血单核细胞；全骨髓诱导法产生的破骨细胞数量和分化效率高于脾细胞诱导的。

图1. 单核细胞向巨噬细胞、树突细胞和破骨细胞分化（图片来自文献1）

二、分离流程

1、解剖操作

• 选取20-30日龄的C57或昆明小鼠，以戊ba比妥钠过量注射或断颈方式处死后，将小鼠固定于超净台内。夹住小鼠脚背皮肤，沿两侧剪开皮肤至腹部，暴露双后肢，取出完整的股骨和胫骨（图2）。

2、组织处理

• 逆关节活动方向用力掰开，分离股骨、胫骨，剔除骨表面残留肌肉（图3）。

• 剪去股骨和胫骨两端，用注射器吸取清洗液，从骨干粗端插针反复冲洗（图4），直至骨头变白透亮（图5）。收集冲洗液于培养皿内 ，轻柔吹打，获得骨髓细胞悬液。

图2. 得到完整的股骨和胫骨	图3. 留取纯净股骨和胫骨图
图4. 从骨头粗的一端插针，搅动、冲洗骨髓	图5. 冲至骨头发白透亮

3、细胞分离

• 将骨髓悬液用滤网进行过滤，用专用清洗液收集滤网上的骨髓细胞，收集的细胞离心后弃上清，保留细胞沉淀。

• 向细胞沉淀中加入3 mL PBS重悬。另取一个新的15 ml离心管，加入4 ml专用分离液。将用PBS重悬的细胞悬液缓慢沿着离心管壁加入4 ml小鼠骨髓单核细胞专用分离液液面上方，形成密度梯度分离液（图6）。

• 以1,500 g，升速1挡，降速1挡，离心25 min。吸取PBS与分离液交界处的细胞，收集于15 ml离心管内，加入PBS至总体积13 mL，经离心机1,800 rpm，离心5 min；丢弃上清，保留沉淀。

图6.液面分层参考图

4、细胞培养

• 将获得的细胞加入专用培养基，于37℃，5%CO₂条件下培养。

• 首次换液在培养48 h后进行。在显微镜下观察，若细胞汇合度在80%以上，可直接丢弃上清换液。

想了解更详细步骤，请查看小鼠骨髓单核细胞分离培养试剂盒说明书

三、细胞鉴定

1、形态鉴定

细胞呈圆形，不规则，细胞核小。

2、标志物鉴定

采用CD68免疫荧光鉴定，细胞纯度可达90%以上。

DAPI	CD68	Merge

图7. 小鼠骨髓单核细胞免疫荧光鉴定

四、培养信息

培养基：小鼠骨髓单核细胞完全培养基（含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等）

换液频率：每2-3天换液一次

生长特性：贴壁

细胞形态：巨噬细胞样

传代特性：不增殖；不传代

消化液：优先用利多卡因（12 mM）消化细胞；若细胞无法消化，更换0.25%胰蛋白酶；若仍然无法消化，加入3 mL完全培养基终止消化，采用无菌细胞刮，直接刮取细胞（此法不推荐，因为细胞容易受到机械损伤而导致死亡）。

五、应用方向

骨髓单核细胞在基础研究与转化医学中具有重要应用价值。

• 在破骨细胞研究中，骨髓单核细胞相比外周血单核细胞更易分化为破骨细胞。在体外培养条件下，它们常被用于评估骨代谢、药物干预以及骨相关疾病机制，如骨质疏松和关节炎。

• 骨髓单核细胞作为髓系免疫前体细胞，能够迁移至组织并分化为巨噬细胞或树突状细胞，参与炎症调控、抗感染和组织修复。越来越多研究表明，骨髓单核细胞分化后的巨噬细胞可通过极化M1/M2表型调控炎症反应，参与多种疾病发展，包括非酒精性脂肪性肝炎、肥胖、糖尿病、脓毒症等。

• 骨髓单核细胞是肿瘤微环境中重要的动态调节成分。它们可被肿瘤动员，并分化为肿瘤相关巨噬细胞（TAM）或髓系抑制细胞（MDSC），在肿瘤发生与进展中发挥促进或抑制作用。

以上是关于小鼠骨髓单核细胞分离培养的全流程干货拆解，精准破解取骨、细胞分离等痛点，助你高效获取高活性BMMNCs～

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参考文献：

[1] Sun Y, Li J, Xie X, Gu F, Sui Z, Zhang K, Yu T. Macrophage-Osteoclast Associations: Origin， Polarization, and Subgroups. Frontiers in Immunology. 2021 December 1; 12: 778078.