实战：大鼠肺大动脉内皮细胞分离培养实操攻略！

肺大动脉作为连接右心室与肺循环的核心血管，其内皮细胞因直接承受来自右心室的高压血流及高剪切力，成为研究心肺血管类疾病的重要模型细胞。然而，这类细胞数量有限，且与平滑肌细胞等紧密相邻，分离过程极易出现细胞混杂的现象，影响实验结果的准确性。

本期细胞学堂以大鼠肺大动脉内皮细胞的分离为例，系统梳理关键操作步骤，助力科研人员高效、规范地制备肺大动脉内皮细胞，为相关研究的顺利开展提供支持。

一、基本信息

细胞名称：大鼠肺大动脉内皮细胞

组织来源：肺大动脉

细胞简介：肺大动脉（亦称肺动脉干）位于心包内，是一条粗短的动脉干，起于右心室流出道，位于主动脉弓前面。在主动脉弓下方分为左、右肺动脉，经肺门入肺。其主要功能是将脱氧血从心脏输送到肺部进行氧合。肺大动脉内皮细胞是血管内壁的主要组成细胞之一，在维持血管内外的动态平衡、合成和分泌细胞因子和介质、调控凝血和纤溶动态平衡中起重要作用。

形态特征：贴壁生长后呈单层多角形“铺路石样”分布，细胞边界清晰、形态均一。

二、分离流程

1、解剖操作

• 选用20-30日龄的Wistar、SD等品系大鼠，用戊ba比妥钠过量注射麻醉处死动物后，消毒仰卧固定。

• 剪开胸部皮肤并暴露胸骨，打开胸腔，去除胸腺，轻提心房，显露肺大动脉与主动脉弓。

• 自血管顶端略偏左向下剪下包含肺大动脉的组织（含心脏、主动脉弓及少量肺组织）（图1)。

2、组织处理

• 用大鼠肺大动脉内皮细胞专用清洗液反复清洗组织，去除血污。

• 剪去心脏底端1/2部位，挤压血管以清理内部凝结的血块，之后再次清洗（图2）。

• 去除主动脉弓与肺大动脉血管之间的脂肪，找到肺大动脉分支血管（图3），并剥离。

• 沿血管根部连接心脏的位置剪下，得到主动脉弓与肺大动脉组织（图4），进一步清理脂肪组织。

• 将主动脉弓与肺大动脉血管剪开（图5），留取纯净的肺大动脉组织，并将其纵向剖开（图6）。

图1. 剪下包含肺大动脉血管的一团组织	图2. 清理完血污的组织团
图3. 找到肺大动脉用显微直镊夹住	图4. 剪下的主动脉与肺大动脉
图5. 用显微剪将两根血管剪开	图6. 纵向剖开肺大动脉

3、组织消化

• 将处理好的肺大动脉组织放入专用消化液中，于37℃、5% CO₂培养箱中消化30 min。

• 消化完成后，加入专用清洗液，吹打悬液约30次，使附着的内皮细胞分散到悬液中，收集悬液。

4、细胞分离

• 将收集的悬液通过100 μm细胞滤网进行过滤，收集滤液于离心管，1,200 rpm离心5 min，弃上清，保留沉淀。

5、细胞培养

• 培养器皿包被：将1 mL大鼠肺大动脉内皮细胞铺板工作液加入6 cm皿中，于37℃，5% CO₂条件下孵育0.5-2 h。

• 细胞接种：细胞用大鼠肺大动脉内皮细胞完全培养基重悬后，接种于包被好的培养器皿中，于37℃，5% CO₂条件下培养。

• 换液与传代：首次换液在48 h后进行，以后每2-3天换液一次，待细胞汇合度达到80-90%即可开始传代。

想了解更详细步骤，请查看大鼠肺大动脉内皮细胞分离培养试剂盒说明书。

三、细胞鉴定

1、形态鉴定

细胞呈“铺路石样”形态，符合内皮细胞典型形态特征。

2、标志物鉴定

采用CD31免疫荧光鉴定，细胞纯度可达90%以上（图7）。

DAPI	CD31	Merge

图7. 大鼠肺大动脉内皮细胞免疫荧光鉴定

四、培养信息

换液频率：PLL（0.1 mg/mL）或明胶（0.1%）

培养基：大鼠肺大动脉内皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率：每2-3天换液一次

生长特性：贴壁

细胞形态：内皮细胞样

传代比例：1:2

传代特性：可传2-3代

消化液：0.25%胰蛋白酶

五、应用方向

在肺血管疾病研究中，肺大动脉内皮细胞常被用于研究细胞增殖/凋亡失衡、线粒体动力学、内皮-间质转化、炎症反应、胞外囊泡介导的细胞间通讯，及基因/非编码RNA的功能验证等。

• 实例1：在人肺大动脉内皮细胞缺氧模型中，Hpgd（羟基前列腺素脱氢酶）在不同缺氧时长中均呈下降趋势。Hpgd可通过调节低氧处理的肺大动脉内皮细胞的增殖、凋亡、粘附性和血管生成能力，从而调节血管重构，参与低氧性肺动脉高压的发生和发展^[1]。

• 实例2：用小鼠肺大动脉内皮细胞构建缺氧细胞模型，以探究circKrt4在低氧性肺动脉高压中的作用。结果显示，circKrt4通过双重机制促进疾病发生：一方面与Pura结合，驱动内皮-间质转化并增强 N-钙黏蛋白表达；另一方面抑制Glpk的线粒体转运，造成线粒体功能障碍。circKrt4通过协同调控Pura和Glpk，加剧肺大动脉内皮细胞损伤并推动疾病进展^[2]。

以上是大鼠肺大动脉内皮细胞分离培养的全流程干货拆解，精准破解血管剥离、纯度把控等实验痛点~

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参考文献：

[1] He M, Tao K, Xiang M, Sun J. Hpgd affects the progression of hypoxic pulmonary hypertension by regulating vascular remodeling. BMC Pulmonary Medicine. 2023 Apr 13; 23 (1): 116.

[2] Qingjiao Chen, Mingui Chen, Jizhen Wang. Prognostic genes related to mitochondrial dynamics and mitophagy in diffuse large B-cell lymphoma are identified and validated using an integrated analysis of bulk and single-cell RNA sequencing, Frontiers in Imeunology, 2025(16).

[3] Ma C, Wang X, Zhang L. Super enhancer-associated circular RNA-circKrt4 regulates hypoxic pulmonary artery endothelial cell dysfunction in mice. Arteriosclerosis Thrombosis And Vascular Biology. 2023;43(7):1179-1198.

[4] Zhao L, Luo H, Li X. Exosomes derived from human pulmonary artery endothelial cells shift the balance between proliferation and apoptosis of smooth muscle cells. Cardiology. 2017; 137 (1): 43-53.